Preparação de seções de tecido pulmonar de camundongo para coloração com isolectina B4 para avaliar a densidade microvascular pulmonar

Para começar, coloque o tecido pulmonar do camundongo em 4% de paraformaldeído, que é 10 vezes o volume do tecido. Após três horas de fixação, separe os cinco lobos pulmonares e incorpore os lobos cranial, médio e acessório do pulmão direito separadamente, orientando-se na direção da conexão lobo-brônquio vertical. Em seguida, corte o lobo caudal do pulmão direito em dois pedaços a quatro milímetros da esquerda para a direita na direção perpendicular à conexão pulmão-lobo-brônquio e incorpore as fatias em um bloco de cera, com a superfície cortada voltada para cima.

Para fazer três cortes no lobo do pulmão esquerdo, corte transversalmente acima da junção brônquica principal, dois milímetros abaixo do topo. Faça o segundo corte transversalmente acima da junção brônquica principal, cinco milímetros abaixo do topo. Faça o terceiro corte no final do lóbulo, oito milímetros abaixo do topo.

Depois de descartar o pedaço superior de tecido, envolva os três pedaços restantes em um bloco de cera, com a superfície cortada voltada para cima. Após a refixação, enxágue o bloco de tecido em água corrente por 15 minutos. Mergulhe sequencialmente o tecido nas concentrações crescentes de etanol, seguido de xileno e cera macia.

Preencha um molde com uma quantidade adequada de parafina líquida e, usando uma pinça, posicione o tecido na estrutura de incorporação no centro. Coloque o molde e o tecido na área de congelamento da máquina de incorporação. Quando a parafina começar a clarear ligeiramente, posicione rapidamente a estrutura de incorporação descoberta no topo do molde e execute a segunda injeção de cera, selando os orifícios na parte inferior da estrutura de incorporação.

Em seguida, transfira todo o molde para a mesa de congelamento. Depois de prender o bloco de cera no fatiador, apare o bloco para revelar uma superfície de corte lisa e plana. Gire a manivela da roda do micrótomo para cortar fatias com uma espessura de quatro micrômetros.

Coloque suavemente as seções removidas na superfície da água sequencialmente. Uma vez que as seções estejam totalmente estendidas, separe as peças quebradas nas junções entre cada seção. Incline uma lâmina de vidro por baixo da seção e, ao entrar em contato, levante lenta e uniformemente a lâmina para fora da superfície da água em um movimento vertical.