Para começar, obtenha uma fatia de tecido pulmonar de camundongo embebida em parafina e coloque-a em um forno a 65 graus Celsius por 60 minutos. Para a coloração, mergulhe a lâmina com a secção de tecido sequencialmente nos frascos de coloração que contêm as soluções adequadas. Diluir a solução de recuperação do antígeno de citrato de sódio modificado 50 vezes com água deionizada.
Depois de pré-aquecer o extrato de antígeno no microondas em alta potência, coloque a lâmina por 15 minutos para ferver. Depois que a lâmina esfriar até a temperatura ambiente, lave-a duas vezes com PBS por cinco minutos cada. Em seguida, permeabilize o tecido com 0,25% de triton duas vezes por 10 minutos cada.
Circunde o tecido com uma caneta de imuno-histoquímica e incube a lâmina com 5% de BSA à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, dilua a isolectina B4, ou IB4, com 1% de BSA para uma proporção de 1 para 50. Depois de remover o excesso de água, incube a seção de tecido com 50 a 100 microlitros do IB4 diluído durante a noite a quatro graus Celsius.
Lave as lâminas três vezes com PBS por cinco minutos cada e permeabilize com 0,25% triton por 10 minutos. Em seguida, incube a seção de tecido com 50 a 100 microlitros de DAPI em temperatura ambiente por cinco minutos. Após três lavagens de PBS, aplique uma gota de meio de montagem anti-desbotamento no slide, evitando a exposição à luz.
Monte a lâmina seca ao ar sob um microscópio de fluorescência para capturar imagens do núcleo e dos sinais do alvo. Este protocolo permite a localização e observação precisas da microvasculatura pulmonar usando IB4 para coloração de microcélulas endoteliais em diferentes lobos pulmonares de camundongos sob um microscópio de fluorescência.
