Para começar, obtenha cortes de tecido pulmonar de camundongo corados com Isolectina B4 ou IB4 e DAPI. Adquira imagens sob um microscópio de fluorescência com uma objetiva de 10x. Importe as imagens para o software ImageJ e selecione-as.
Divida os canais de acordo e carregue o arquivo no formato ND2 para canais DAPI e IB4. Navegue até Analisar, Definir escala. Configure os parâmetros da imagem e selecione Global, seguido de OK.To definir o mesmo intervalo de exibição, vá para Imagem, ajuste o contraste de brilho e clique em Definir.
Defina o intervalo de exibição para IB4 como zero a 10.000 e para DAPI como zero a 20.000. Para eliminar o plano de fundo, clique em Processo, seguido de matemática. Subtraia o sinal de fundo com base nos valores detectados pela ferramenta varinha mágica no plano de fundo.
Para selecionar o melhor valor de limite, vá para Imagem e clique em Duplicar. Selecione o tipo de imagem original e duplicada para 8 bits. Em seguida, na guia Imagem, selecione Ajustar seguido de Limites e Modos de entrada.
Depois de escolher o limite mais realista, selecione Fundo escuro e aplique. Usando a ferramenta varinha mágica, selecione vasos sanguíneos maiores em comparação com a imagem duplicada e clique em Excluir para eliminar sinais positivos para IB4 de grandes artérias e veias. Para contar o número de sinais de destino, clique em Analisar, seguido de Definir medidas e marque Área, Limitar ao limite e Exibir rótulo.
Em seguida, selecione Analisar partículas e modifique Tamanho como zero a infinito, Circularidade como zero a um e Mostrar como máscaras de sobreposição. Marque Resumir e clique em OK. Por fim, escolha Resumo. Clique em Arquivo e salve os resultados.
A porcentagem de focos positivos para IB4 nos lobos cranial, médio, caudal, acessório e esquerdo pode ser distinguida entre os camundongos jovens e de meia-idade usando a análise ImageJ.
