Fixação e bloqueio de culturas de células endoteliais da veia umbilical humana 2D (HUVEC) para análise imuno-histoquímica

Para começar, adicione 30 mililitros de hidróxido de potássio a 5% em metanol a um tubo de 50 mililitros. Incubar 100 lamínulas com diâmetro de 12 milímetros no tubo por 30 minutos sob agitação constante. Em seguida, lave as lamínulas em água desmineralizada por 30 minutos.

Quando a lavagem estiver concluída, transfira as lamínulas para uma solução isopropílica a 70% para armazenamento. Para revestir as lamínulas, primeiro encoste-as individualmente na parede de uma placa de Petri quadrada. Quando o álcool isopropílico tiver evaporado, transfira-os para uma placa de 24 poços.

Pipete um mililitro de colágeno em PBS em cada poço e incuba. Em seguida, lave as lamínulas cerca de 4 a 5 vezes por cinco minutos cada com um mililitro de PBS. Pipeta cultivou HUVECs nos poços com as lamínulas revestidas.

Depois de cultivar as células por um período de tempo desejado, lave-as em um mililitro de PBS por cinco minutos. Fixe as células em um mililitro de 2% de paraformaldeído por 20 minutos em temperatura ambiente. Agora, enxágue as células em um mililitro de PBS por 3 a 4 ciclos de lavagem de cinco minutos cada.

Finalmente, pipete um mililitro de tampão de bloqueio na placa do poço antes de colorir.