Para começar, adicione HUVECs em um tubo Falcon de 10 mililitros contendo oito mililitros de meio de crescimento endotelial. Adicione dois mililitros de solução estoque de METHOCEL no tubo e agite bem. Em seguida, transfira 25 microlitros da mistura para a superfície interna invertida de uma placa de Petri grande e quadrada.
Gire suavemente a tampa em 180 graus e coloque-a no fundo de um recipiente de cultura de células e incube durante a noite. No dia seguinte, adicione 2,3 mililitros de colágeno de cauda de rato Tipo I a um frasco contendo 0,28 mililitros de 10X Medium 199. Mantenha esta mistura no gelo e misture até ficar uniformemente amarela.
Titular a mistura contra hidróxido de sódio até que fique laranja. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão HEPES ao produto final. Colete as células cultivadas penduradas em um tubo Falcon de 50 mililitros com 20 mililitros de PBS e centrifugue.
Depois de descartar o sobrenadante, adicione 0,1 mililitros de FBS e 0,4 mililitros de meio basal endotelial ao pellet esferóide. Bata suavemente no tubo para ressuspender o pellet. Agora, pipete dois mililitros de solução estoque METHOCEL e misture bem.
Em seguida, adicione dois mililitros da mistura de colágeno preparada aos esferóides ressuspensos. Dispense 0,5 mililitros da mistura resultante nos poços de uma placa de 24 poços e incuba. Em seguida, pipete 100 microlitros de fator de crescimento endotelial vascular humano recombinante diluído nos poços da placa.
Incube a cultura de células a 37 graus Celsius sob 5% de suplementação de dióxido de carbono por 12 horas. No dia seguinte, com um microscópio invertido, capture as imagens dos esferoides que não estão em contato com a borda do poço, entre si ou apresentam sinais de danos. Os esferoides estimulados apenas com meio basal ou fator de crescimento endotelial vascular humano recombinante foram claramente distinguíveis.
Esferóides em géis de baixa qualidade pareciam cair no chão e se dispersar. O controle negativo mostrou uma taxa de brotação basal moderada, enquanto o fator de crescimento endotelial vascular humano dobrou ou triplicou o comprimento relativo da brotação O número de brotos apresentou uma faixa dinâmica semelhante.
