Imunocitoquímica de esferoides de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) em uma matriz de colágeno 3D para investigação da angiogênese in vitro

Para começar, fixe os géis esferóides HUVEC germinados em um mililitro de paraformaldeído a 4% por uma hora. Lave os géis suavemente em um mililitro de PBS cerca de três a quatro vezes. Separe os géis totalmente da superfície de cada poço da placa e transfira-os para novas placas de 24 poços.

Adicione um mililitro de solução de bloqueio à placa do poço e, em seguida, incube em um agitador orbital por uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, pipetar 500 microlitros da solução de anticorpo primário nos poços antes da incubação. No dia seguinte, lave os géis suavemente com PBS por cinco ciclos de lavagem de cinco minutos cada.

Adicione 500 microlitros do anticorpo secundário correspondente diluído com faloidina-FITC no tampão de bloqueio. Incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador orbital. Depois de lavar os géis em PBS, transfira-os para lâminas de microscópio.

Adicione duas gotas de meio de montagem contendo DAPI em uma lamínula e coloque-a sobre cada gel. Sele os géis secos com esmalte. Coloque-os no escuro antes de armazená-los a quatro graus Celsius até uma análise mais aprofundada.