Para começar, prepare e posicione o rato anestesiado para eletrofisiologia. Aplique pulsos de onda quadrada catártica monofásica para estimular o nervo frênico para registrar as respostas CMAP. Aumente a intensidade do estímulo progressivamente até que a amplitude da resposta pare de aumentar.
Em seguida, aumente a intensidade do estímulo para aproximadamente 120% do nível necessário para uma resposta máxima para garantir a estimulação supermáxima e registre uma resposta adicional. Meça e documente as amplitudes pico a pico do CMAP em milivolts. Administre estimulação submáxima com duração de 0,1 milissegundos a uma frequência de 1 hertz.
Aumente gradualmente a intensidade em incrementos de 0,03 miliamperes para obter respostas incrementais até que uma resposta mínima de todos ou nenhuma seja alcançada. Em seguida, adquira a resposta inicial com uma intensidade de estímulo variando entre 2 e 10 miliamperes. Depois de salvar a primeira resposta incremental, adquira incrementos adicionais com intensidades de estímulo progressivamente mais altas em incrementos de 0,03 miliamperes.
Certifique-se de que o pico negativo inicial das respostas incrementais esteja alinhado temporariamente com o pico negativo da resposta máxima do CMAP. Dado o envolvimento do diafragma na respiração, verifique a estabilidade e a ausência de fracionamento em cada resposta incremental para confirmar a consistência em três respostas duplicadas. Observe as respostas incrementais em tempo real e sobreponha-as em gravações anteriores para distinção visual.
Em seguida, confirme se a amplitude de incremento é de pelo menos 25 microvolts. Depois de registrar 10 respostas incrementais, verifique se a amplitude de cada incremento não excede 1/3 da amplitude total da resposta final. Para estimar a amplitude média do SMUP, calcule a média dos valores de 10 incrementos.
Em seguida, divida a amplitude máxima do CMAP pela amplitude média do SMUP para determinar o MUNE. Sete dias após a injeção intrapleural de CTB-SAP, o MUNE diminuiu para 60 unidades motoras funcionais em ratos adultos em comparação com 74 em ratos controle. A amplitude do CMAP permaneceu relativamente estável, sugerindo brotamento colateral como um possível mecanismo compensatório.
CMAP do diafragma, SMUP e MUNE foram medidos ao longo de 28 dias após a injeção. O CMAP não mostrou nenhuma mudança notável. O aumento médio no SMUP para ratos CTB-SAP foi de aproximadamente 50 a 60%As mudanças foram significativas ao longo do tempo e atribuídas ao CTB-SAP.
O MUNE foi reduzido em aproximadamente 40% em ratos CTB-SAP, indicando efeitos significativos do tempo no tratamento com CTB-SAP.
