Para começar, carregue cinco microlitros de solução hoechst em uma seringa Hamilton de vidro estéril de 10 microlitros, conectada a uma agulha romba de calibre 34. Insira esta agulha de seringa na câmara anterior através do túnel da córnea autovedante e injete a solução. Segure a agulha no lugar por dois a três segundos, até que todo o fluido desapareça.
Puxe a agulha lentamente para removê-la, evitando vazamentos. Em seguida, enuclee os dois olhos. Para isolar as córneas, corte a esclera ao redor do nervo óptico e faça quatro cortes adicionais do nervo óptico em direção à córnea.
Drene o excesso de líquido com o papel de filtro Whatman. Espalhe a esclera cortada e separe a retina da esclera. Retire e descarte a lente e a retina.
Em seguida, remova a íris. Corte e descarte a esclera ao redor da córnea. E levante cuidadosamente a córnea.
Colocando as córneas em uma lâmina de vidro, core-as com vermelho de alizarina 0,5% para identificar as células endoteliais. Depois de remover o excesso de mancha, lave a córnea três vezes e coloque uma lamínula sobre ela. Examine as córneas sob um microscópio óptico para obter imagens da coloração com vermelho de alizarina das células endoteliais.
Além disso, avalie as córneas em um microscópio fluorescente para observar a coloração de Hoechst e compare-a com a córnea não injetada como controle. O corante Hoechst, um marcador fluorescente permeável a células de ligação ao DNA, foi utilizado para avaliar a biodisponibilidade do medicamento por meio de injeção intracameral. A captação de células endoteliais da córnea do hoechst foi examinada 15 minutos após a injeção por microscopia fluorescente.
A coloração com vermelho de alizarina destacou as bordas intercelulares da camada endotelial. Além disso, a coloração positiva de Hoechst nos núcleos das células endoteliais da córnea confirmou a entrega bem-sucedida do corante por meio desse método.
