Para começar, prepare o tampão de lavagem suplementando a solução salina balanceada de Hank com tampão de 10 pilhas milimolares. Armazene o buffer a quatro graus Celsius até o uso. Prepare o epitélio pigmentar da retina ou o meio RPE em DMEM e pré-aqueça a 37 graus Celsius em banho-maria.
Coloque o rato sacrificado de lado com o olho voltado para cima. Coloque o dedo indicador acima do olho e o polegar abaixo dele. Aplique uma leve pressão na estrutura óssea ao redor do olho para fazer com que o globo ocular se projete.
Insira a ponta da tesoura ligeiramente aberta sob o olho e gire suavemente o pulso para longe do olho 90 graus até que o olho se desprenda da órbita. Coloque imediatamente e role o olho em etanol 70% por cinco segundos. Em seguida, transfira o olho para um tampão de lavagem mantido no gelo.
Sob um microscópio de dissecação, coloque o olho em uma placa de Petri cheia de tampão de lavagem e tiras de gaze embebida. Estabilize o olho segurando o nervo óptico com uma pinça e, usando uma faca cirúrgica, faça suavemente uma incisão no nível da Ora Serrata. Insira a tesoura Vannas na incisão e corte ao redor da circunferência da Ora Serrata até que o segmento anterior e o vítreo sejam removidos.
Retire suavemente a retina da ocular usando uma pinça amarrada sem perturbar a camada de EPR. Com a ajuda de uma tesoura, remova o nervo óptico e o excesso de tecido conjuntivo da ocular sem perfurar a ocular. Transfira a ocular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de 0,25% de tripsina e 0,02% de EDTA.
incube a ocular em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos. A cada dois minutos, remova o tubo e bata firmemente na parte inferior 40 vezes na bancada. Após a incubação, usando a pipeta AP-1000, misture suavemente para cima e para baixo três vezes para interromper a ocular.
Para neutralizar a tripsina, coloque imediatamente as folhas de EPR destacadas, excluindo a ocular, em 0,5 mililitros de FBS em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione mídia RPE nas camadas de folhas FBS e RPE para diluir a tripsina. Centrifugue o RPE a 340G por três minutos.
Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células numa quantidade adequada de meio RPE para uma placa de 24 poços. Incube o RPE a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três dias. 24 horas após o isolamento do EPR, as células pigmentadas nucleadas começam a se estabelecer sem adesão total.
Ao longo das 48 a 72 horas, essas células se ligam e se espalham, retendo a pigmentação escura em um núcleo transparente. Após cinco dias, as células RPE mostram aumento da fluência de co no início da formação de contatos célula a célula, moldando-se em uma monocamada polarizada com estruturas hexagonais. O EPR isolado mostrou pureza evidenciada pelo marcador específico do EPR e integridade da junção apertada após seis dias em cultura.
