Para começar, coloque a cultura de células Sf1Ep tripsinizada e uma placa de 6 poços em uma plataforma de trabalho. Adicione o número apropriado de células Sf1Ep e meio Sf1Ep a cada poço de uma placa de 6 poços. Incube as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite.
Combine os componentes do TpCM-2 em um recipiente estéril, adicionando ditiotreitol como pó seco por último. Misture e esterilize suavemente o meio usando uma unidade de filtro de 0.22 micrômetro. Pré-equilibre o meio em um frasco anaeróbico, evacue a câmara usando o aspirador doméstico e reabasteça com uma mistura de 95% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono três vezes.
Em seguida, reabasteça com 1,5% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e equilibre a mistura de gás nitrogênio. Transfira rapidamente o meio para uma incubadora tri-gás, configurada a 34 graus Celsius e incube durante a noite. Após a incubação durante a noite, remova o meio da cultura de Sf1Ep e lave as células com um pequeno volume do TpCM-2 pré-equilibrado.
Depois de remover o enxágue, adicione uma quantidade adequada de TpCM-2 e equilibre a placa em 1,5% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e equilibre a atmosfera de nitrogênio a 34 graus Celsius por três a quatro horas. Remova a cultura de T. pallidum existente da incubadora de baixo oxigênio e examine a camada de células Sf1Ep em cada poço. Depois de registrar a densidade e a aparência das células, pipetar o meio de cada poço para um tubo cônico estéril de 15 mililitros.
Enxágue cada poço com 0,35 mililitros de tripsina-EDTA pré-aquecido e adicione o enxágue ao tubo de 15 mililitros. Adicione mais 0,35 mililitros de tripsina-EDTA a cada poço e incube por cinco minutos a 37 graus Celsius para remover as células Sf1Ep da placa e T.pallidum da célula Sf1Ep. Após o descolamento, combinar as células dissociadas de T. pallidum e Sf1Ep com o meio de reserva coletado no tubo cônico de 15 mililitros e registrar o volume total recuperado para cálculo do rendimento por cultura.
Inocular a placa previamente preparada de células Sf1Ep com um volume definido do T. pallidum colhido. Depois de trocar a atmosfera na placa, incube a 34 graus Celsius dentro do frasco da cervejaria ou em uma incubadora tri-gas. Após a inoculação, use uma câmara de contagem auxiliar para enumerar T. pallidum sob microscopia de campo escuro.
Adicione 50% de glicerol a uma concentração final de 10% à cultura de T. pallidum e disperse o glicerol por meio de pipetagem ou inversão suave. Distribua a preparação em alíquotas de um a dois mililitros em frascos de freezer com tampa de rosca e coloque imediatamente os frascos em um freezer de 80 graus Celsius ou em um freezer de nitrogênio líquido. Prepare e pré-equilibre duas placas de 96 poços com 1000 células Sf1Ep e 200 microlitros de TpCM-2 por poço e incube durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos.
No dia seguinte, substitua o meio Sf1Ep por TpCM-2 conforme descrito anteriormente. Após a quantificação, diluir T. pallidum em TpCM-2 para produzir duas preparações com concentrações de 10 e 40 células por mililitro. Inocular 50 microlitros por alvéolo da preparação de 10 T. pallidum por mililitro em uma das 96 placas de ell preparadas.
Nos dois poços de controle em cada placa, inocular o 2 x 10 à potência de três T. pallidum por mililitro de diluição. Equilibre as placas com a mistura de gás com baixo teor de oxigênio e incuba-as em uma jarra de cerveja ou incubadora de gás triplo a 34 graus Celsius. No sétimo dia, remova metade do meio e substitua-o por TpCM-2 novo e equilibrado.
Uma vez que os poços positivos são identificados por microscopia de campo escuro, tripsinize os poços positivos e transfira a suspensão celular para as placas de 24 poços previamente preparadas para expansão adicional. T. pallidum normalmente retém mais de 90% de motilidade e se multiplica logaritmicamente com um tempo de duplicação de 33 a 45 horas por aproximadamente sete dias antes de entrar na fase estacionária. Ao longo de uma semana, as espiroquetas passaram por aproximadamente quatro a cinco duplicações.
