Para começar, coloque os trofozoítos Naegleria gruberi congelados a 37 graus Celsius por três minutos. Cultive os trofozoítos em meio PYNFH a 25 graus Celsius até aproximadamente 80% confluente. Coloque o frasco confluente no gelo por cinco a 10 minutos para liberar os trofozoítos aderidos do plástico.
Em seguida, gire suavemente o frasco para desalojar quaisquer células aderentes restantes. Substitua o meio por meio de encistamento estéril para encistar as células de Naegleria gruberi. Após 48 horas, retirar os quistos do balão.
Centrifugue os cistos a 600 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, ressuspenda os cistos em dois mililitros de meio PYNFH com soro de bezerro fetal a 10% para excistar as células. Incubar os cistos a 25 graus Celsius por 72 horas até que os trofozoítos surjam e atinjam 80% de confluência.
Para transfectar os trofozoítos, primeiro coloque um mililitro dos trofozoítos em uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de seis poços. Em seguida, incube a mistura de reagentes de transfecção de plasmídeo em temperatura ambiente por 10 minutos. Pipete aproximadamente 800 microlitros de meio das monocamadas de trofozoítos imediatamente antes da transfecção.
Em seguida, adicione 200 microlitros da mistura de reagentes de transfecção de plasmídeo aos trofozoítos. Gire suavemente a placa a cada 15 minutos para evitar que a mídia se agregue nas bordas da placa e seque. Após uma hora, adicione 10 unidades de DNase em um mililitro de tampão DNase 10X e adicione-o aos poços.
Incube a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos para remover o DNA do plasmídeo residual. Agora lave o prato uma vez com um mililitro de meio de crescimento e, em seguida, adicione dois mililitros de mídia fresca. Incube a placa a 25 graus Celsius por 24 a 36 horas.
Quando a incubação estiver completa, divida o conteúdo de um poço em uma nova placa na proporção de 1:2. Em seguida, colete os trofozoítos dos poços restantes para análise posterior. Os trofozoítos de Naegleria gruberi eram amebóides e aderentes aos frascos de cultura em condições de cultura padrão.
Sua incubação no gelo resultou em trofozoítos redondos e não aderentes. A incubação dos trofozoítos em meios de encistamento fez com que eles se tornassem encistados.
