Para começar, adicione 200 microlitros de cloreto de sódio 100 milimolar a um tubo contendo trofozoítos transfectados de naegleria gruberi. Centrifugue o tubo a 600G por 10 minutos a 4 graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de EDTA 100 milimolares.
Coloque o tubo em um bloco de calor por 15 minutos a 98 graus Celsius para lisar as células. Centrifugue o tubo a 4 graus Celsius por 10 minutos em velocidade máxima para pellet os detritos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
Em seguida, adicione 0,5 volumes de acetato de amônio, três volumes de etanol absoluto e um microlitro de glicogênio ao sobrenadante. Inverta o tubo várias vezes para misturar, antes de incubá-lo a menos 80 graus Celsius por 30 minutos ou durante a noite. Após a incubação, centrifugue os tubos em temperatura ambiente por 10 minutos a 16.000G.
Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione 200 microlitros de etanol a 70% para lavá-lo antes de centrifugar. Ressuspenda o pellet seco em água deionizada estéril para atingir uma densidade de trofozoítos de 10.000 trofozoítos por microlitro. Após PCR com primer específico para o DNA transfectado e detecção dos trofozoítos transformados, adicione dois microlitros de corante de carga 6X às amostras CERE.
Em seguida, carregue as amostras tingidas em um gel de agarose a 0,8%. Após eletrofluorescer o gel por 1,5 a 2 horas, incube-o em corante de DNA diluído em 100 mililitros de água deionizada. Transfira o gel manchado para água deionizada por 20 minutos para removê-lo.
Visualize o gel em um sistema de luz ultravioleta para documentar os resultados. A análise de PCR mostrou que o pGRUB foi detectado em trofozoítos transfectados em pelo menos sete passagens. O pGEM foi perdido após a primeira passagem, indicando que o plasmídeo vazio não foi retido pelas amebas.
