Para começar, cultive MSCs em uma placa de seis poços com o meio MSC humano contendo 1% de penicilina e estreptomicina. Em seguida, prossiga com a marcação das células ARPE19 Mito-RFP com traço celular violeta na membrana citoplasmática. Para fazer isso, adicione 20 microlitros de dimetilsulfóxido a um frasco de reagente violeta de traço celular e misture bem imediatamente antes de usar.
Cultive as células ARPE19 Mito-RFP até a densidade desejada de 80 a 90%Para preparar a solução de carga, dilua a solução estoque de violeta de traço celular em DPBS pré-aquecido. Em seguida, remova o meio de cultura das células e substitua-o por um mililitro de solução de carga. Incube as células por 10 minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, remova a solução de carregamento. Depois de lavar as células duas vezes com DPBS, adicione dois mililitros de meio fresco e completo. Em seguida, incube as células por pelo menos 10 minutos a 37 graus Celsius para permitir que o traço celular violeta sofra hidrólise de acetato.
Em seguida, prepare uma placa de 24 poços adicionando 50 microlitros de DPBS em cada poço. Insira a lamínula na placa e deixe-a repousar durante um minuto. Remova o DPBS dos poços usando pressão negativa para garantir que a corrediça da tampa esteja próxima ao fundo do prato.
Quando a densidade celular atingir 80 a 90%, remova o meio original e lave as células uma vez com DPBS, adicione um mililitro da mistura de tripsina EDTA DPBS e incube por três a quatro minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, bata suavemente na placa de seis poços para separar as células aderidas. Adicione um mililitro de meio fresco e completo para terminar a digestão.
Em seguida, ressuspenda suavemente todas as células com uma pipeta e transfira todas as células coletadas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Agora centrifugue as células a 200 G por cinco minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em um mililitro de meio fresco.
Coloque 10 microlitros de suspensão celular em uma placa de contagem para enumeração. Depois de semear as células MSCs e ARPE19 na placa de 24 poços, observe as células ao microscópio. Agite a placa até que as células estejam uniformemente distribuídas.
Incube-os na cultura por 24 horas. Para co-cultura indireta, consulte 10.000 células ARPE19 em 500 microlitros de meio por poço de uma placa de 24 poços. Coloque a inserção no poço onde as células foram semeadas.
Semeie 10.000 células-tronco mesenquimais em 100 microlitros de meio na câmara celular superior por poço.
