Para começar, pegue as células MSC-Mito-GFP e ARPE19-Mito-RFP co-cultivadas e remova o meio das placas de 24 poços. Lave todas as células uma vez com 500 microlitros por poço de 4% de poli formaldeído. Adicione 500 microlitros de formaldeído 4% poli fresco e fixe as amostras por 20 minutos.
Em seguida, remova o fixador e lave as amostras três vezes por 10 minutos cada com DPBS. Após remover o PBS, adicione 500 microlitros por poço de solução de bloqueio e incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução de bloqueio.
Para preparar a solução de coloração de faloidina, dilua a solução de armazenamento 400x para 1x com PBS. Adicione 200 microlitros de solução de coloração de faloidina a cada poço e incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, recupere a solução de coloração e lave as amostras por 10 minutos com DPBS.
Depois de remover o PBS, retire a lamínula com uma agulha de seringa e deixe-a secar ao ar. Aplique uma pequena quantidade de meio de montagem na corrediça e vire cuidadosamente a lamínula na corrediça para garantir que a lamínula cubra uniformemente toda a superfície. Sele as bordas com esmalte.
Nanotubos de tunelamento ou estruturas de TNT foram observados, estabelecendo conexões intercelulares entre tipos de células semelhantes e diferentes. A transferência mitocondrial foi observada em células ARPE-19 contendo fluorescência pontilhada verde de MSCs e em MSCs contendo fluorescência pontilhada vermelha de células ARPE-19. A imagem de super-resolução confirmou a formação de TNTs e detalhou a transferência mitocondrial via TNTs.
A quantificação mostrou que as MSCs eram significativamente mais capazes de doar mitocôndrias em comparação com células ARPE-19.
