Para começar, coloque o mouse anestesiado em um aparelho estereotáxico. Faça uma incisão contínua ao longo da linha média do couro cabeludo usando uma tesoura cirúrgica e corte parte do couro cabeludo para expor a superfície do crânio. Faça a craniotomia na região especificada com a micro broca e defina quatro pontos como borda.
Pare de perfurar quando o tecido cerebral se tornar visível. Use o painel de controle para configurar o injetor para injetar 80 nanolitros do vírus. Clique no botão Injetar no painel de controle para injetar o vírus no giro dentado a uma taxa de fluxo de 1 nanolitro por segundo.
Para aspirar o tecido cerebral, gire a ponta da agulha romba bem acima do tecido cerebral e pressione suavemente para facilitar a aspiração. Enxágue continuamente com solução salina fria durante a sucção para manter uma visão clara do cérebro. Observe as características do tecido de perto para monitorar a profundidade da aspiração.
O tecido cortical é rosa pálido. O corpo caloso abaixo aparece como tecido fibroso branco. E a camada CA1 do hipocampo é vermelha escura e cinza.
Pare a sucção quando a superfície do tecido ficar lisa e uma grande área de CA1 for exposta. Mova o suporte preso à lente de sorriso acima do orifício perfurado. Quando a lente do sorriso entrar em contato com a superfície do tecido cerebral, defina o eixo Z como zero.
Insira a lente do sorriso no orifício no eixo ventral dorsal menos 1,32 milímetros. Deixe o suporte repousar por 5 a 10 minutos. Em seguida, levante o suporte e enxágue o orifício com solução salina.
Usando uma agulha, aplique a resina ultravioleta ao redor da lente do sorriso. Ilumine a área com luz ultravioleta por 15 segundos para garantir que a resina fique sólida. Remova cuidadosamente o suporte da lente sorridente.
Cubra todo o crânio exposto com resina ultravioleta. Coloque a placa de cabeça no crânio na posição apropriada. Ilumine todo o crânio e a placa da cabeça com luz ultravioleta por 15 segundos.
Cubra a lente de sorriso exposta com uma tampa protetora impressa em 3D. Fixe a tampa na placa da cabeça usando parafusos M1.6. Ative o software de controle Miniscope e clique em Selecionar arquivo de configuração.
Em seguida, selecione vscode, seguido por Arquivos de configuração do usuário. Agora, clique em Executar. Em seguida, deslize o botão liga/desliga do LED para ajustar o brilho.
Deslize o botão de ajuste de foco para definir o valor próximo de zero. Fixe a placa de base ao miniscópio e reajuste a posição do miniscópio para obter um campo de visão com boa qualidade de imagem. Aplique cuidadosamente a primeira camada de material de base da prótese ao redor da placa de base do mini osciloscópio.
Assim que a primeira camada do cimento endurecer, aplique uma segunda camada de cimento da placa de base na placa principal. Depois que todo o material de base da prótese endurecer, solte o parafuso de fixação e solte o mini osciloscópio da placa de base. Coloque a tampa da placa de base na placa de base para proteger a lente de sorriso exposta e aperte o parafuso de fixação.
Após a geração de imagens, converta os dados de imagem do formato AVI para HDF5. Aplique a correção de movimento não rígida e reduza a resolução do filme corrigido de movimento. Aplique extrato nos dados de downsample para identificar sinais de célula única.
Em seguida, aplique a verificação de célula e selecione manualmente as células potenciais. Clique em Salvar Dados antes de fechar a janela de verificação de célula. Por fim, salve os arquivos de dados.
Em imagens de cálcio in vivo malsucedidas, nenhuma célula ativa foi observada no campo de visão da imagem. Imagens de cálcio in vivo bem-sucedidas mostraram menos de 10 células ativas sem vasos sanguíneos óbvios. Mais de 50 células ativas com vasos sanguíneos visíveis.
E centenas de células ativas com vasos sanguíneos limpos. Células individuais extraídas de um registro de imagem de cálcio in vivo bem-sucedido foram sobrepostas ao campo de visão com traços representativos de cálcio mostrados. A posição da expressão de GCaMP6F e o trajeto da lente do sorriso foram verificados na fatia do cérebro do camundongo.
