Para começar, em uma coifa de cultura de células, adicione o lipoaspirado colhido em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Transfira o lipoaspirado para uma seringa Luer lock estéril de 20 mililitros. Em seguida, conecte um conector de 1.4 milímetro à seringa.
Agora conecte uma segunda seringa Luer lock de 20 mililitros no lado contralateral do conector. Empurre o tecido adiposo de uma seringa para a outra cerca de 30 vezes. Em seguida, transfira a gordura emulsionada para um novo tubo de centrifugação de 50 mililitros.
Centrifugue a gordura a 500 G por 10 minutos. Em seguida, descarte a camada superior oleosa. Recolha a camada central purificada que contém a camada vascular estromal separada e transfira-a para um novo tubo de centrifugação de 50 mililitros.
Agora encha o tubo da centrífuga com DMEM suplementado até a marca de 40 mililitros. Centrifugar novamente o tubo a 500 G durante cinco minutos. Colete a camada mSVF resultante e transfira-a para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Em um tubo estéril de 1,5 mililitro, pipete 100 microlitros da fração vascular estromal isolada. Para isso, adicione 10 microlitros de trombina e, em seguida, pipete 10 microlitros de cloreto de cálcio. Por fim, adicione 70 microlitros de ácido tranexâmico à mistura.
Com uma ponta de pipeta nova, adicione 10 microlitros de fibrinogênio ao tubo pouco antes da aplicação. Após a polimerização da mistura de hidrogel mSVF, pipetar 200 microlitros do hidrogel em uma placa de 12 poços para fins analíticos. Agora adicione 100 microlitros de hidrogel de fibrina em um poço como controle negativo.
Incube a placa de 12 poços a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio de cultura pré-aquecido a cada poço. Coloque a placa de 12 poços de volta na incubadora novamente por quatro horas.
Adicione um mililitro de resazurina a cada poço antes de incubar novamente por 24 horas. Pipetar as amostras de resazurina para uma placa de 96 poços. No dia seguinte, use um leitor de microplacas multimodo de imagem celular para medir a primeira intensidade de fluorescência.
Para análise histológica nos dias um, três e sete, incubar o hidrogel de fibrina em 0,5 mililitros de paraformaldeído a 4%. Agora adicione 1% de PBS ao prato e armazene-o a quatro graus Celsius. O ensaio de resazurina foi realizado para quantificar as viabilidades celulares in vitro da fração vascular e do hidrogel.
A fração vascular mostrou viabilidade reduzida no terceiro dia, enquanto a combinação mSVF-hidrogel de fibrina permaneceu próxima da linha de base. No sétimo dia, a viabilidade do mSVF caiu, enquanto a combinação mSVF-hidrogel de fibrina aumentou. A análise histológica não mostrou redução no número de núcleos celulares nos dias três e sete.
O hidrogel de fibrina exibiu degradação mínima com aglomerados de células visíveis uniformemente distribuídos.
