Para começar, obtenha a microglia humana a partir das células-tronco embrionárias humanas e colha-as no dia 56. Para a derivação organoide da retina, cultive as células-tronco embrionárias humanas em um meio de células-tronco até que a densidade celular atinja 80 a 90%Adicione um mililitro de dispase por poço às células de cultura e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Depois de remover o dispase, adicione um mililitro de D médio a cada poço.
Corte as células em pedaços pequenos. Com uma pipeta de 10 microlitros, colete suavemente todos os pedaços de células e meio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 200 x g durante cinco minutos.
Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda suavemente as células em 200 microlitros de uma matriz fria. Mova o tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para uma incubadora por 20 minutos. Após 20 minutos na incubadora, a matriz se solidificará.
Prepare um prato de 10 centímetros com 15 mililitros de meio D.Ressuspenda a matriz com o meio D e agite a placa de Petri suavemente. Coloque o prato em uma incubadora por cinco dias. No dia 12, substitua o meio por três mililitros de dispase.
Após cinco minutos, aspire a dispase e adicione 15 mililitros de meio E. Introduza a micróglia colhida nos organoides retinianos digeridos no dia 12. No dia 19, gire suavemente a placa para agregar os organoides ao centro da placa e substitua o meio E pelo meio F. Finalmente, transfira os organoides com o meio F para uma nova placa de suspensão. No dia 30, os organoides retinianos co-cultivados com microglia mostraram autofluorescência significativa de GFP, indicando a presença de microglia.
Os organoides retinianos co-cultivados exibiram sinais claros de imunofluorescência para o marcador fotorreceptor CRX e o marcador microglial IBA1.
