Para começar, obtenha os parasitas do estágio de anel sincronizado com sorbitol de plasmodium falciparum. Prepare 50 mililitros de tampão citomix 2x e dilua 1 a 1 com água estéril. Em seguida, lave 100 microlitros de hemácias parasitadas em estágio de anel embalado duas vezes com 5 mililitros de tampão citomix 1X e centrifugue-os a 994G por três minutos em temperatura ambiente.
Depois de remover o tampão, adicione 50 microgramas de cada plasmídeo nas células, seguido por um volume apropriado de 2x tampão. Ajuste o volume para 400 microlitros com 1x tampão antes de transferir a solução preparada para cubetas de 0,2 centímetro para cada transfecção. Em seguida, eletropore as células com cuidado.
Após a eletroporação, misturar e incubar as células com meio RPMI completo num balão T25 com um volume total de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue os parasitas transfectados em um tubo cônico de 50 mililitros a 994G por três minutos. Após remover o sobrenadante, lave os parasitas com 10 mililitros de RPMI incompleto.
Cultive-os com RPMI completo fresco por dois dias, reabastecendo o meio após 24 horas. Após 48 horas, remover o RPMI completo de cada balão. Ressuspenda a cultura em RPMI completo adicionado com drogas.
Incubar a cultura em um frasco T75 junto com 400 microlitros de glóbulos vermelhos frescos por quinze dias No dia 14, alíquota de 200 microlitros da cultura transfectada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue o tubo a 500G por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois de aspirar o sobrenadante, transfira as células para uma lâmina e coloque outra lâmina em um ângulo de 45 graus para fazer um esfregaço.
Após a fixação do metanol, mergulhe a lâmina na coloração de Giemsa por 20 minutos. Lave o escorregador em água corrente e seque-o bem. Observe a lâmina sob um microscópio óptico com ampliação de 100x após a aplicação do óleo de imersão.
Uma vez que os parasitas são visualizados, reabasteça o meio diariamente por dois a três dias.
