Para começar, pegue uma alíquota de 75 microlitros contendo um miligrama de esferas magnéticas revestidas de estreptavidina ligadas ao DNA e remova o sobrenadante com o rack magnético. Lave as contas com 200 microlitros de tampão de carregamento. Em seguida, ressuspenda as esferas em 75 microlitros de tampão de carregamento e misture suavemente pipetando.
Em seguida, adicione o complexo de reconhecimento de origem a uma concentração final de 37,5 nanomolares ao DNA ligado a contas e incube a reação por cinco minutos a 30 graus Celsius com agitação de 800 rotações por minuto. Adicionar CDC6 a uma concentração final de 50 nanomolares e incubar a reacção como já demonstrado. Em seguida, adicione Mcm2-7 Cdt1 a uma concentração final de 100 nanomolares e incube a reação por 20 minutos, conforme demonstrado anteriormente.
Depois disso, adicione DDK a uma concentração final de 100 nanomolares e incube de forma semelhante por 30 minutos. Depois de remover o sobrenadante, lave o DNA ligado ao grânulo contendo hexâmeros Mcm-2-7 fosforilados com 200 microlitros de tampão de lavagem com alto teor de sal. Misture pipetando, garantindo que as contas sejam totalmente ressuspensas.
Em seguida, remova o tampão e lave os grânulos uma vez com 200 microlitros de tampão CMG. Para montar e ativar o CMG marcado com fluorescência no DNA ligado ao grânulo, remova o tampão CMG e ressuspenda os grânulos ligados ao DNA em 50 microlitros de tampão CMG suplementado com cinco ADP milimolar. Em seguida, misture todos os componentes mencionados na tela em um tubo e coloque-o no gelo.
Adicione imediatamente o DNA ressuspenso à mistura de proteínas. Incube a reação por 15 minutos a 30 graus Celsius com agitação de 800 RPM. Lave o cordão sequencialmente com tampão HSW e tampão CMG.
Depois de remover o tampão, ressuspenda o CMG contendo esferas magnéticas ligadas ao DNA em 200 microlitros de tampão de eluição e, em seguida, incube em temperatura ambiente por uma hora com agitação de 800 RPM. Coloque o tubo em um rack magnético e deixe as contas serem coletadas por cinco minutos. Recolha cuidadosamente o sobrenadante que contém os complexos DNA-CMG eluídos sem perturbar os grânulos assentados e transfira-o para um novo tubo.
Para garantir que não restam esferas na solução, coloque novamente o sobrenadante coletado em uma prateleira magnética e guarde por mais cinco minutos cuidadosamente. Colete o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo. Adicione 1.400 microlitros de tampão CMG aos 200 microlitros de sobrenadante.
A amostra agora está pronta para imagens de molécula única.
