Para começar, obtenha células HEK 293T e coloque 800.000 células por poço em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em meio DMEM suplementado. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para atingir 60 a 80% de confluência. Em seguida, misture um micrograma de cada DNA de plasmídeo com 200 microlitros de DMEM sem soro e seis microlitros de reagente de transfecção.
Após 15 minutos de incubação, dispensar 100 microlitros de mistura de transfecção por poço de células. Incube durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No terceiro dia, adicione uma quantidade apropriada de rapamicina ou etanol separadamente às células e incube-as por uma hora em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, coloque o prato no gelo e lave suavemente as células com três mililitros de PBS frio. Depois de remover o PBS, adicione 300 microlitros de tampão de lise contendo rapamicina ou etanol e raspe as células com um raspador de células. Transferir a amostra para um tubo de 1,5 mililitros e microcentrifugá-la durante 10 minutos a 1 000 g a quatro graus Celsius.
Para verificar os níveis de expressão, alíquota de 20 microlitros do sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mililitro. Incube a amostra com 20 microlitros de tampão Laemmli 2x contendo 5% de beta mercaptoetanol a 95 a 100 graus Celsius por cinco minutos.
