Para iniciar a transformação das células de Escherichia coli BL21 DE3, descongele alíquotas de 50 microlitros de suspensão celular competente no gelo. Adicione um microlitro de DNA do plasmídeo pET 28a Sumo TRF2 à suspensão celular competente e gire suavemente o tubo para misturar a suspensão. Após a transformação, espalhe 100 microlitros da suspensão celular em uma placa de ágar luria bertani, ou LB, contendo 50 microgramas por mililitro de canamicina.
Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, escolha uma colônia das células transformadas e cultive-a em cinco mililitros de meio LB, suplementado com 50 microgramas por mililitro de canamicina. Incubar por 18 horas a 37 graus Celsius, com agitação a 220 RPM.
Após a incubação, induzir a cultura com um IPTG milimolar como concentração final. Incube a 20 graus Celsius por 17 horas para promover a expressão de proteínas. Carregue os extratos de proteína bruta, juntamente com o tampão de carregamento, em um gel SDS-PAGE.
Execute as amostras inicialmente a 100 volts por 30 minutos, seguidas por 120 volts por 50 minutos em um tampão de trisglicina. Em seguida, core com azul de Coomassie para visualizar a expressão da proteína. Para a purificação das proteínas, centrifugar o extracto de proteína bruta a 38 000 g durante 40 minutos a quatro graus Celsius e filtrar o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,22 micrómetros.
Carregar o sobrenadante filtrado na coluna de níquel pré-equilibrada no tampão de ligação. Lave a coluna com tampão de ligação e elua a proteína com o gradiente de imidazol preparado, coletando 12 frações de um mililitro cada. Adicione glicerol a uma concentração final de 50% à proteína concentrada e trocada por tampão para armazenamento.
A expressão de TRF2 em Escherichia coli foi demonstrada com sucesso, como mostrado por SDS-PAGE, onde bandas distintas correspondentes a TRF2 apareceram antes e depois da indução.
