Para começar, centrifugue uma vez 10 elevado à potência de sete linhas celulares HeLa contendo fragmentos de restrição telomérica DNA a 1.000g por três minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 microlitros de PBS. Após o tratamento com proteinase K e cloreto de sódio SDS, centrifugue a suspensão celular a 16.900g por 10 minutos.
Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrifugação e adicionar um volume igual de isopropanol, evitando a flutuação de lípidos ou sedimentos. Centrifugue em alta velocidade e lave o pellet com 500 microlitros de etanol a 70%. Depois de secar o pellet de DNA, ressuspenda-o cuidadosamente em 475 microlitros de tampão TE e misture suavemente batendo no fundo do tubo.
Agora, adicione 25 microlitros de 10 miligramas por mililitro de RNAsay e bata no tubo até que o pellet esteja completamente dissolvido. Em seguida, adicione 1/10 volume de acetato de sódio de três molares e dois volumes de etanol 100% frio e coloque o tubo a 80 graus Celsius negativos por duas a três horas. Após a centrifugação e lavagens com etanol a 70%, adicione 100 microlitros de tampão TE ao pellet de DNA, bata no tubo para misturar e coloque-o a quatro graus Celsius por duas horas para dissolver completamente.
Para a digestão do DNA, combine quatro microgramas de DNA genômico com um microlitro de CviAII, dois microlitros de tampão de digestão 10X e água para atingir um volume total de 20 microlitros. Incube a mistura a 25 graus Celsius por 12 horas. Em um termociclador, aqueça a mistura a 75 graus Celsius por três minutos.
Em seguida, diminua a temperatura em 0,1 graus Celsius a cada 30 segundos até atingir 25 graus Celsius. Após a limpeza e secagem, cubra as lamínulas inferiores com 20 microlitros de 0,1% de nitrocelulose e adicione contas de referência. Asse as lamínulas a 100 graus Celsius por quatro minutos.
Monte o sanduíche de célula de fluxo. E depois de aquecer a 85 graus Celsius, use dois cotonetes para massagear o conjunto até que o Parafilm sele o canal. Lave 10 microlitros de contas M-270 cinco vezes com 50 microlitros de tampão de trabalho usando um ímã.
Após a lavagem, adicione as esferas em cima do DNA genômico digerido em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Agite suavemente o tubo algumas vezes para misturar as contas e a amostra de DNA. Deixe a mistura no gelo por uma hora.
Após a incubação, lave a mistura com 500 microlitros de tampão de trabalho três vezes usando um ímã para puxar as contas para baixo com intervalos de 10 minutos entre as lavagens. Ressuspenda a amostra em um tampão de trabalho e carregue 30 microlitros da mistura na célula de fluxo. Lave as esferas magnéticas não ligadas após 30 minutos.
Depois de colocar a célula de fluxo em cima da lente objetiva, selecione um par de ímãs cúbicos de cinco milímetros dispostos em uma configuração vertical e alinhe o suporte do ímã com o eixo x do caminho da luz da pinça magnética para a imagem. Inicie o software de programação gráfica e conecte os controladores para as pinças magnéticas. Ajuste o campo de view para localizar um cordão de referência na parte inferior da célula de fluxo e ajuste a lente objetiva ligeiramente para que o cordão de referência mostre anéis de defração claros.
Escreva um script no MATLAB para controlar os movimentos motores para ensaios de rampa de força. Importe o script para o software de programação gráfica para testar os experimentos de molécula única. Em uma taxa de fluxo lenta, carregue 200 microlitros de TRF1 de 10 nanomolares na célula de fluxo.
Após 30 minutos de associação, escolha um script para um experimento de rampa de força com uma taxa de carregamento de força de mais/menos um piconewton por segundo. Nomeie os arquivos de dados e execute o experimento. A integridade do DNA genômico foi confirmada usando eletroforese em gel de agarose, com o TRS resultante exibindo comprimentos consistentes em várias linhagens de células humanas.
Sequências de repetições teloméricas em TRS foram detectadas via southern blotting, mostrando sinais claros de hibridização. As curvas de extensão de força do ensaio de rampa de força mostraram padrões em zigue-zague durante o alongamento, indicando a quebra das interações do DNA da proteína. A cinética de dissociação dos complexos proteicos de DNA telomérico mostrou uma relação linear entre força e taxa de dissociação.
Além disso, a heterogeneidade de comprimento do DNA telomérico de células humanas investiga o mecanismo de formação de alças em telômeros de vários comprimentos.
