Para começar, organize o tampão de bloqueio esterilizado com filtro recém-preparado, o tampão de reação 10X um e dois em uma plataforma de trabalho. Coloque tubos abertos contendo 2.5 mililitros de tampão de bloqueio e cinco mililitros de água ultrapura em um dessecador e desgaseifique sob vácuo. Após 15 minutos, libere a pressão e remova os tubos.
Coloque o conjunto de célula de fluxo biotina-PEG preparado em um microscópio stage e prenda-o usando massa adesiva em cada extremidade. Conecte a tubulação de saída da célula de fluxo à bomba da seringa por meio de uma agulha. Ligue o aquecedor da objetiva para 30 graus Celsius.
Prenda de um a dois mililitros de água desgaseificada em um tubo em um pedaço separado de massa adesiva perto da célula de fluxo. Insira a tubulação de entrada no tubo até atingir o fundo e flua a água pelo canal. Aumente a taxa de fluxo para remover quaisquer bolhas presas perto da tubulação de entrada.
Adicione 100 microlitros de tampão de bloqueio desgaseificado a uma alíquota de 20 microlitros de um miligrama por mililitro de estreptavidina. Prenda o tubo aberto à massa adesiva. Transfira a tubulação de entrada da água para a estreptavidina e inicie o fluxo a uma taxa de 40 microlitros por minuto por dois minutos.
Após cinco minutos, lave o excesso de estreptavidina com o tampão de bloqueio. Fluxo em DNA biotinilado diluído em tampão de bloqueio contendo 25 nanomolares SYTOX Orange. Imagem usando visualização ao vivo com o laser de 532 nanômetros para assistir o DNA se ligando à superfície em tempo real.
Uma vez alcançada a densidade desejada de DNA na superfície, flua em um tampão de bloqueio contendo 25 nanomolares SYTOX para lavar o DNA livre. Agora, fluxo e anticorpo anti-digoxigenina biotinilado diluído em tampão de bloqueio contendo 25 nanomolares SYTOX Orange. Lave o anticorpo anti-digoxigenina biotinilado e o SYTOX Orange com tampão de bloqueio.
Fluxo de 50 microlitros de mistura de ATP-gama-S na célula de fluxo. Adicione a helicase CMG purificada a aproximadamente 100 concentrações finais nanomolares em 30 microlitros de mistura de ATP-gama-S e flua a 20 microlitros por minuto para 20 microlitros. Incube por 15 minutos.
Em seguida, fluxo na mistura de ATP RPA a 40 microlitros por minuto para 80 microlitros. Usando cada laser com exposição de 50 a 100 milissegundos, visualize e adquira EGFP RPA com um laser de 488 nanômetros e, em seguida, adquira CMG com um laser de 640 nanômetros. Finalmente, visualize e adquira o DNA corado com SYTOX Orange com um laser de 532 nanômetros.
O desenrolamento do DNA da CMG helicase foi visualizado pelo crescimento linear do RPA amarelo rastreado ao longo do tempo, indicando as fitas de DNA desenroladas. O dano ao DNA de fita simples reduziu o número de eventos de desenrolamento bem-sucedidos observados, conforme demonstrado por menos traços completos nos dados.
