Para começar, prepare o buffer mestre. Filtre-o usando um filtro de tamanho de poro de 0,22 micrômetro e armazene o tampão a 4 graus Celsius. Em seguida, prepare 75 mililitros de tampão de extração suplementando o tampão mestre com três comprimidos inibidores de protease livres de EDTA, 2 milimolares de ATP e 0,1 milimolar de DTT.
Em seguida, adicione 75 mililitros de tampão de extração ao pellet de células bacterianas congeladas que expressa miosina VIIA e deixe o pellet no tampão de extração no gelo até descongelar. Depois disso, use uma pipeta sorológica para quebrar o pellet para acelerar o processo de descongelamento. Agora sonicar a ressuspensão no gelo por 10 minutos a 50% de amplitude usando uma ponta de meia polegada com 5 segundos ligados e 5 segundos desligados.
Centrifugar o lisado total a 33.746 g durante 30 minutos a 4 graus Celsius. Durante a centrifugação, lave 3 mililitros da pasta de 50% de resina de afinidade anti-FLAG com 40 mililitros de PBS para preparar 1,5 mililitros de resina FLAG. Em seguida, centrifugue a resina a 800 G por 2 minutos a 4 graus Celsius.
Remova cuidadosamente o PBS sem mexer na resina. Em seguida, adicione o sobrenadante da centrifugação do lisado à resina lavada e incube com rotação contínua a 4 graus Celsius por 1 hora. Pulverize a resina centrifugando a 800 G por 2 minutos a 4 graus Celsius.
E remova o sobrenadante sem perturbar a resina. Em seguida, ressuspenda a resina em 40 mililitros de tampão mestre e centrifugue a 800 G por 2 minutos a 4 graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a resina.
Agora transfira a resina lavada para duas colunas giratórias de polipropileno. Lave cada coluna uma vez com 2 mililitros de tampão mestre. Em seguida, centrifugue a coluna a 1.400 G por 2 minutos a 4 graus Celsius para remover o tampão mestre.
Para preparar um tampão de eluição, adicione 100 microgramas por mililitro de peptídeo FLAG ao tampão mestre. Adicione 300 microlitros de tampão de eluição à resina compactada em cada coluna. Misture suavemente pipetando para garantir que a resina esteja completamente hidratada pelo tampão de eluição.
Em seguida, centrifugue as colunas a 1.400 G por 2 minutos a 4 graus Celsius. Transfira o fluxo para um tubo de microcentrífuga limpo e mantenha-o no gelo. Agora, execute SDS-PAGE com as frações de eluição para determinar suas concentrações relativas.
Enquanto o gel funciona, prepare um tampão de diálise com a composição fornecida. Em seguida, combine as frações mais concentradas. Transfira a amostra para um de diálise de corte de 10.000 pesos moleculares e dialise durante a noite a 4 graus Celsius.
No dia seguinte, descarregue cuidadosamente a amostra do de diálise. Alíquota de 15 microlitros por tubo de PCR e coloque os tubos em um recipiente de nitrogênio líquido para congelamento instantâneo. O complexo de miosina VIIA purificado foi confirmado por SDS-PAGE, mostrando uma banda acima do marcador de Dalton de 200 quilos, correspondendo à cadeia pesada da miosina VIIA, e três bandas distintas entre os marcadores de Dalton de 22 e 14 quilos representando calmodulina RLC e proteína 4 semelhante à calmodulina.
