Para começar, adicione um volume de câmara de proteína miosina-7a humana purificada em tampão de motilidade de cloreto de sódio milimolar de 500 milimolares à câmara de fluxo e incube-a por cinco minutos em temperatura ambiente. Lavar a câmara de fluxo com três volumes de câmara de um miligrama por mililitro de BSA em tampão de motilidade de cloreto de sódio a 150 milimolares. Depois disso, retire o líquido usando um pano limpo na saída para absorver o excesso de líquido.
Em seguida, flua um volume de câmara de F-actina marcada com rodamina-faloidina 10 nanomolares em tampão de motilidade de cloreto de sódio 150 milimolar através da câmara de fluxo. Monitore a ligação dos filamentos de actina à superfície sob um microscópio fluorescente com uma objetiva de 100x. Garanta a densidade ideal do filamento de actina para rastreamento, com filamentos suficientes no campo de visão, mas esparsos o suficiente para evitar sobreposição.
Em seguida, lave a câmara de fluxo com três volumes de câmara de tampão de motilidade de cloreto de sódio 150 milimolares para remover os filamentos de actina não ligados e o excesso de rodamina-faloidina. Para iniciar a motilidade, adicione um volume de câmara do tampão final à câmara de fluxo. Em seguida, registre imagens em um microscópio de fluorescência usando excitação de 561 nanômetros para visualizar a actina marcada com rodamina-faloidina.
Encontre uma área no slide com a densidade de actina desejada e capture imagens a cada 30 segundos por 30 minutos. Em seguida, baixe e instale o programa Fast do repositório GitHub. Certifique-se de que seja a versão compatível com Python 3 com um módulo adicional para conversão de arquivo ND2.
Execute o programa Fast usando um valor de tolerância de 33 para reter apenas filamentos que se movem suavemente. Depois, use o programa Fast para analisar as imagens TIFF recém-criadas. Defina o valor máximo x como 20.000 nanômetros e o valor máximo y como 20 nanômetros por segundo para representar o comprimento e a velocidade máxima do filamento mais longos.
Em seguida, use px para definir o tamanho do pixel da imagem adquirida para 65 nanômetros. Defina minV para 0,1 nanômetros por segundo como a velocidade mínima necessária para a inclusão do filamento na análise. Para definir a distância máxima permitida entre os quadros para os filamentos a serem vinculados, use maxD, evitando a ligação de filamentos separados entre os quadros.
Use pt para definir a tolerância para flutuações nas velocidades do filamento, incluindo apenas os filamentos com movimentos suaves. Por fim, use d para indicar a pasta que contém as pilhas TIFF para análise. O ensaio de deslizamento do filamento de actina demonstrou a motilidade lenta da miosina-7a, com a reprodução do vídeo acelerada 500 vezes para visualizar o movimento.
A distribuição de velocidade da miosina-7a apresentou um pico abaixo de cinco nanômetros por segundo, confirmando sua motilidade lenta.
