Para começar, lave as sementes certificadas de Pinus pinaster em água corrente da torneira para remover detritos maiores. Em seguida, lave os detritos mais finos usando uma solução detergente comum com agitação vigorosa. Em uma capela de fluxo, adicione uma solução de alvejante comercial até que as sementes estejam cobertas e misture vigorosamente por 15 minutos.
Depois de descartar a solução de alvejante, enxágue as sementes três vezes com água da torneira esterilizada. Agora mergulhe as sementes em etanol a 80% por 15 minutos com agitação vigorosa. Após o descarte do etanol, lave as sementes três vezes com água ultrapura esterilizada.
Para a germinação do pinheiro, quebre os tegumentos esterilizados com um torno mecânico estéril. Isole os pinhões e coloque-os em um recipiente fechado com papel de filtro úmido esterilizado para hidratar durante a noite. No dia seguinte, estratificar os pinhões hidratados a quatro graus Celsius por sete dias para quebrar a dormência e sincronizar a germinação.
Em seguida, mantenha os pinhões no escuro a 25 graus Celsius até a germinação. Transfira os pinheiros germinados assépticos para condições ambientais controladas por duas semanas ou até que o caule principal comece a se desenvolver. Após duas semanas, corte a parte aérea da muda acima da raiz com um bisturi e transfira-a para um meio de cultura Schenk Hildebrandt esterilizado.
Manter a cultura em condições ambientais controladas, conforme descrito anteriormente. Subcultive periodicamente cortando o tecido caloso na base do broto com um bisturi estéril. Transfira o cacho de brotos usando uma pinça estéril para um novo meio de cultura de multiplicação.
Em seguida, inocular os microbrotos no meio de cultura Schenk Hildebrandt contendo três gramas por litro de carvão ativado para alongamento do microcaule. Agora coloque os brotos alongados no meio de cultura Schenk Hildebrandt sem fitohormônios ou carvão ativado. Adicione 100 a 150 nematóides de madeira de pinho esterilizados em estágio de vida misto na parte inferior do microbroto.
Manter a cultura em condições ambientais controladas, conforme descrito anteriormente. O estabelecimento e a infecção de brotações de pinus in vitro mostraram o aparecimento de agulhas cloróticas dentro de um mês de co-cultivo com nematóides da madeira de pinus.
