Para começar, pegue neurônios cultivados em frascos T25 para co-cultura. Substitua o meio por cinco mililitros de solução versena contendo tripsina e Dnase I.Adicione 0,5 mililitros de soro fetal bovino para neutralizar a tripsina e Dnase I.Transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave o frasco com cinco mililitros de meio neurobasal completo uma vez para maximizar os neurônios coletados.
Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda suavemente o pellet celular em dois a três mililitros de meio neurobasal completo. Semear 100 microlitros da suspensão celular em cada poço para obter 75.000 neurônios por poço, entre oito a 10 dias de cultivo de glia mista.
Usando uma pipeta de 10 mililitros, lave suavemente os frascos T75 com meios de cultura de glia para coletar a microglia e transfira as células e o meio para um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Centrifugue a coleção de células a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Uma vez removido o sobrenadante, ressuspenda suavemente o pellet em dois mililitros de meio neurobasal completo.
Da placa de cultura neuronal de 96 poços, remova 100 microlitros de meio neurobasal e adicione 100 microlitros de 250.000 células por mililitro de suspensão celular. Em co-cultura, microglia redonda e grande foram observadas no topo ou entre neurônios e processos neuríticos.
