Para começar, cultive o tecido cerebelar picado recuperado de um filhote de camundongo de 10 dias em águia média basal. Adicionar produtos químicos prejudiciais ao ADN directamente no meio de cultura em concentrações finais adequadas. Após o período de exposição, substituir o meio por um meio misturado recentemente preparado contendo os produtos químicos prejudiciais ao ADN e o inibidor da poli ADP ribose glicohidrolase e incubar durante 30 minutos.
Após 30 minutos, lave as fatias com tampão fosfato 0,1 molar à temperatura ambiente e fixe-as imediatamente com uma mistura pré-resfriada de acetona e metanol. Incube a placa por 20 minutos a menos 20 graus Celsius. Em seguida, remova a solução de fixação e lave-a com tampão fosfato molar 0,4.
Adicione 100 microlitros de tampão fosfato 0,1 molar a cada poço de uma placa de 48 poços. Em seguida, use um bisturi e uma tábua de corte para remover as margens da inserção, cortando ao redor da fatia de tecido. Coloque a fatia em um poço da placa de 48 poços.
Depois de aspirar o tampão, incube o inserto com 100 microlitros de tampão fosfato 0,1 molar contendo 1% Triton X100. Aspirar a solução e incubar em série a inserção em cada alvéolo num agitador com quantidades adequadas de solução de bloqueio seguida da primária nos anticorpos secundários. Adicione 20 microlitros da solução final de DAPI a cada poço 20 minutos antes do final da incubação de duas horas com o anticorpo secundário e continue agitando por 20 minutos.
Para a montagem, coloque o tecido em uma lâmina de vidro de microscópio com o tecido voltado para cima. Adicione o meio de montagem e cubra com uma lamínula. Coloque as lâminas em uma superfície plana e deixe-as secar durante a noite no escuro a quatro graus Celsius.
A foliação cerebelar foi mantida na cultura. As células de Purkinje foram coradas para Calbindina D-28K e os núcleos neurais corados para NeuN. Os astrócitos nas células de Purkinje foram corados para GFAP.
A coloração de PAR aumentou nas células de Purkinje tratadas após a exposição ao bromato de potássio e ao paraquat, indicando danos ao DNA.
