Para começar, adicione 500 microlitros de tampão de imagem livre de proteína ao canal 3 da célula de fluxo. Misture dois nanomolares de Saccharomyces cerevisiae NAP1 e dois a cinco nanomolares de octâmero de histona H4 marcado com LD655 com 500 microlitros de tampão 1X HR. Adicione esta mistura ao canal 4 da célula de fluxo.
Flua todos os canais a 1,0 bar por 30 segundos para lavá-los com amostras. Defina o fluxo para 0,2 bar e mova as armadilhas ópticas para o canal 1 para capturar um par adequado de esferas revestidas com estreptavidina. Em seguida, mova as armadilhas ópticas para o canal 3.
Desligue o fluxo e realize uma calibração forçada para o par de contas. Ligue o laser confocal vermelho e calibre a área de imagem. Depois de definir o fluxo para 0,2 bar, mova as armadilhas ópticas para o canal 2 para capturar o DNA biotinilado.
Em seguida, mova as armadilhas ópticas para o canal 3 e interrompa o fluxo. Aumente a distância entre as armadilhas ópticas para esticar o DNA e monitore a curva de distância forçada associada para confirmar a presença de uma única amarra de DNA. Ajuste a distância entre as armadilhas ópticas para que a tensão do DNA leia aproximadamente um piconewton.
Ligue a varredura de linha para começar a coletar um quimógrafo com o laser vermelho ligado. Em seguida, mova as armadilhas ópticas para o canal 4 com o fluxo para formar nucleossomos ao longo da corda de DNA. Para desembrulhar nucleossomos, mova as armadilhas ópticas para o canal 3.
Definindo a leitura de força para 0 e a velocidade para 0.1 micrômetros por segundo, afaste a armadilha óptica 1 da armadilha óptica 2. Misture 10 nanomolares de histona de ligação marcada com Cy3 H1.4 a 500 microlitros de buffer de imagem e adicione ao canal 5. Depois de formar uma corda de DNA contendo nucleossomos, ligue o laser verde, além do laser vermelho, e mova as armadilhas ópticas para o canal 5 para obter imagens em tempo real da ligação de H1 à cromatina.
A formação de nucleossomos ao longo da corda de DNA foi visualizada como focos fluorescentes vermelhos estacionários em uma varredura 2D e quimógrafo. A análise de fotobranqueamento mostrou eventos de fotobranqueamento de uma ou duas etapas, indicando a presença de mononucleossomos. Na ausência de NAP1, os octâmeros de histonas se ligaram ao DNA, mas permaneceram principalmente desembrulhados, indicados pela tensão constante.
Usando H2A marcado com Cy3, resultados semelhantes de montagem de nucleossomos foram obtidos, como com H4 marcado com LD655. O desenvoltório do nucleossomo aumentou a distância do laço ao longo do tempo, visível no quimógrafo, e gerou curvas de distância forçada com rasgos característicos que denotam o desenvoltório de nucleossomos individuais. A ligação da histona H1 do ligante à cromatina foi indicada por focos fluorescentes verdes com trajetórias estacionárias de duas cores representando a ligação de H1 aos nucleossomos e trajetórias irregulares verdes representando trajetórias de H1 em difusão.
