Comece preparando um estoque de infecção por Pseudomonas aeruginosa de unidades formadoras de colônias conhecidas por mililitro antes da infecção. Para peletar a matéria-prima de infecção, centrifugue a 10.000 x g por cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em PBS.
Em seguida, prepare três tubos de microcentrífuga de um mililitro contendo água destilada estéril, etanol ou PBS estéril. Inspecione uma seringa Hamilton estéril de 100 microlitros, certificando-se de que a ponta da agulha esteja afiada e não tenha desenvolvido um gancho que possa causar trauma significativo no local da infecção. Agora lave a seringa sequencialmente com água destilada, etanol e PBS antes das infecções, retirando e descartando a capacidade máxima.
Em seguida, vórtice o inóculo de infecção ressuspenso e aspire um máximo de 100 microlitros na seringa de Hamilton, o suficiente para injetar 10 microlitros por larva. Em seguida, injete cada larva de Galleria mellonella com 10 microlitros de inóculo na proleg traseira direita. Incube as larvas infectadas entre 20 graus Celsius e 42 graus Celsius, que é uma faixa apropriada para a sobrevivência de Galleria mellonella.
Preparar uma ampla gama de doses que excedam a gama terapêutica esperada do agente antimicrobiano, guiadas por dados de toxicidade in vitro. Injete Galleria mellonella saudável e estéril em grupos apropriados com as diferentes concentrações de veículos antimicrobianos e PBS. Para otimizar o tratamento da infecção bacteriana em Galleria mellonella, prepare uma faixa adequada de doses de agentes antimicrobianos com base em testes preliminares de toxicidade.
Infecte grupos de larvas com bactérias, conforme descrito anteriormente, duas horas após a infecção. Trate as larvas com o agente antimicrobiano preparado ou solução de controle do veículo. Monitore a sobrevivência de Galleria mellonella em intervalos de 30 minutos ou com mais frequência a partir do momento em que a mortalidade é geralmente observada pela primeira vez.
Remova todas as larvas mortas e registre a hora da morte. Para comparar como o tempo de tratamento afeta a mortalidade, trate as larvas em 2, 4, 6, 9 ou 12 horas após a infecção e monitore sua sobrevivência em um intervalo de 30 minutos. A dose efetiva de tobramicina variou de acordo com a cepa.
Cinco miligramas por quilograma foi ideal para PAO1 e PA14,2,5 miligramas por quilograma para PAK e 10 miligramas por quilograma para IST27 mucóide. Nenhuma dose foi eficaz para LESB58. O tratamento com cinco miligramas por quilograma de tobramicina duas, quatro e seis horas após a infecção resultou em mais de 50% de sobrevida de larvas de Galleria mellonella infectadas por Plasmodium aeruginosa.
