Para começar, obtenha a planta Nicotiana benthamiana infiltrada com as células de Agrobacterium tumefaciens que abrigam os vetores desejados. Para estudos de localização de proteínas, colha duas folhas de duas plantas em momentos diferentes após a infiltração. Usando uma lâmina, corte a zona de infiltração em fatias longe da veia.
Coloque a amostra de tecido com o lado abaxial para cima em uma gota de água estéril no centro de uma lâmina de microscópio. Cubra a lâmina com uma lamínula, garantindo que não fiquem presas bolhas. Visualize o sinal fluorescente de etiquetas autofluorescentes na área infiltrada com um microscópio confocal de varredura a laser.
Colete 20 imagens para cada condição usando pelo menos duas réplicas biológicas independentes. Pontue a localização plasmodésmica da proteína testada com base na aparência puntiforme diagnóstica do sinal na periferia da célula. As proteínas TVCV MP-EGFP e PDL5-EGFP demonstraram clara localização pontilhada em plasmodesmos.
Enquanto o PDCB1-EGFP mostrou localização tanto para plasmodesmos quanto para retículo endoplasmático no primeiro dia, após a infiltração. Tanto o MP quanto o PDLP5 começaram a se acumular nos plasmodesmos no primeiro dia após a infiltração, atingindo intensidade máxima no segundo dia e permaneceram estáveis por cinco dias. PDCB1 exibiu forte localização do retículo endoplasmático até o terceiro dia, após o qual a localização plasmodésmica tornou-se visível em menos células.
