Para derivar macrófagos da medula óssea de camundongos adultos do tipo selvagem, coloque as células da medula óssea em uma placa de fundo plano tratada opticamente com 96 poços contendo DMEM suplementado com 10% FBS e 10% LCCM. Incube as células a 37 graus Celsius com 7% de dióxido de carbono por 10 dias. Após a diferenciação, pipetar 75 microlitros da suspensão de Mycobacterium abscessus nos macrófagos contendo poços.
Incube as células a 37 graus Celsius com 7% de dióxido de carbono por quatro horas. Usando um dispensador de reagente de microplaca, equipado com um pequeno, adicione 110 microlitros de DMEM suplementado com 10% FBS e 10% LCCM nos compostos ou colunas de controle de solvente. Dispense 104 microlitros adicionais de DMEM suplementados com 10% de FBS e 10% de LCCM nas colunas que contêm a maior concentração do composto ou solvente.
Agora pipete 5,9 microlitros dos compostos ou solvente em seus poços designados nas colunas. Usando uma micropipeta multicanal, execute duas diluições seriais para cada composto e solvente. Após a última diluição, descarte os 110 microlitros de meio excedentes do último poço.
Adicione 110 microlitros de DMEM suplementado com 10% FBS e 10% LCCM em todas as colunas, excluindo poços em branco. Preparar uma solução de claritromicina a uma concentração de dois microgramas por mililitro num DMEM. Após a incubação, remova a placa de 96 poços contendo macrófagos infectados da incubadora.
Usando uma lavadora de placas, lave as células três vezes com 200 microlitros de solução de lavagem de infecção. Transfira 200 microlitros dos compostos para a placa que contém os macrófagos infectados. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de cultura celular suplementado e solução de claritromicina em seus respectivos poços.
Incube a placa a 37 graus Celsius com 7% de dióxido de carbono por 48 horas. Após a incubação, lave as células infectadas três vezes cada uma com 200 microlitros da solução de lavagem dos compostos. Usando uma micropipeta multicanal, dispense 200 microlitros de solução de fixação em todos os poços e incube por 10 minutos.
Após a lavagem das células, transfira 200 microlitros de solução permeável para todos os poços e incube por 15 minutos. Em seguida, aspire a solução permeável antes de adicionar 100 microlitros da solução de coloração em todos os poços. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente.
Após a incubação, lave as células três vezes com 200 microlitros da solução de lavagem do composto. Para filtrar a placa usando um sistema de imagem de alto conteúdo, selecione o Tipo de placa como 96 placa de microtitulação. Objetiva como 20X com abertura numérica de 0,4 e Modo para Confocal.
Em seguida, selecione o canal DAPI, CellMask deep red e mCherry para capturar os núcleos corados, citoplasma e sinal de bactéria, respectivamente. Selecione os poços da placa e os respectivos campos de cada poço para a análise. Em seguida, clique no teste e capture uma imagem para verificar as configurações.
Por fim, configure um robô de manuseio de equipamentos para automatizar a aquisição de imagens durante a noite. Este braço robótico troca as placas no sistema de imagem de alto conteúdo sem intervenção humana. Os compostos daunorrubicina, doxorrubicina, tiostrepton, epirrubicina e pamoato de pirvinio foram tóxicos para os macrófagos infectados por micobactérias, levando a menos de 85% de viabilidade celular.
Os compostos moxalactama e besifloxacina apresentaram viabilidade inferior a 50% das micobactérias a 13,3 micromolares, mas não mostraram diferença significativa em relação ao controle DMSO. Os compostos cefdinir, gatifloxacino e moxifloxacino foram potentes contra micobactérias intracelulares em 13,3 micromolares, sendo o composto pamoato de pirvinio o mais ativo. Os compostos roxitromicina, claritromicina e rifabutina mostraram extrema potência contra micobactérias intracelulares, com a claritromicina reduzindo a viabilidade da micobactéria para menos de 10% em todas as concentrações.
