Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Institutes of Health (GM070736) para H. Fölsch. SF Ang foi apoiada por um * STAR A bolsa de Pós-Graduação e RS Kang foi apoiada pela Base Celular e Molecular do Programa de Treinamento de Doenças (GM8061)

1. Isolamento de DNA plasmidial <ol><li> Use uma endotoxina livre de Sigma-Aldrich maxiprep kit para preparar DNA endotoxina livre de acordo com protocolo do fabricante. Este kit funciona para nós, porque é confiável remove qualquer endotoxinas das preparações de DNA. Endotoxinas que são injetados com o DNA em núcleos de células irá levar à morte celular. </li><li> Adicionar 100 ul de fenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) para o DNA isolado, vortex e centrifugação por 1 min a 13.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf. Transferir a fase superior de água em um novo tubo e adicionar 100 mL de clorofórmio / isoamylalcohol (24:1), vórtice e girar como acima. Transferir a fase superior de água contendo o DNA a um novo tubo. Este passo é necessário para remover qualquer proteína do DNA, o que impede o entupimento da agulha de microinjeção. </li><li> Precipitar o DNA pela adição de acetato de sódio (pH 6,0) para uma concentração final de 300 mM e 2 X de etanol 100% vol. Incubar a -20 ° C durante a noite. Spin-DNA por 20 min a 13.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf, lave uma vez com etanol 70%, e ressuspender em 300 endotoxina livre mL de água (Sigma-Aldrich). </li><li> Determinar a concentração de DNA. A concentração de DNA típico varia de 1 a 5 mg / mL. </li></ol> 2. Cultura de células MDCK <ol><li> Dividir células MDCK. Contagem de células e de sementes de 4 X 10 5 células para limpar filtros de 12 mm Transwell (0,4 mM tamanho dos poros, Corning Costar, 3460). Para um experimento contendo uma injeção de mock-controle e dois diferentes proteínas Rab mutante você precisa semente três filtros. </li><li> Células MDCK cultura em meio MEM com 2 mM L-glutamina 0,1 mg / ml de penicilina / estreptomicina e 7% (vol / vol) de soro fetal bovino (= media de crescimento MEM) a 37 ° CO C e 5% 2., </li><li> Mudança de mídia na câmara basolateral todos os dias. Isso ajuda o processo de polarização, porque imita a situação de células epiteliais nos animais. </li><li> 2 dias cheque pós-semeadura em um microscópio se as células estão crescendo em uma monocamada fechado. Se você não consegue detectar todos os furos na monocamada, realize sua experiência no dia 3. Se ainda há buracos, faça sua experiência no dia 4. </li></ol> 3. Procedimento microinjeção e Pós-injeção incubações <ol><li> No dia do experimento preparar 5 ml de mídia MEM crescimento mais 50 mM HEPES, em uma chapa de 60 mm x 15 para cada filtro e coloque em uma incubadora de 39 ° C. Além disso, criar um poço de uma placa de 12 bem com 1 ml meios de crescimento MEM acrescido de 50 mM HEPES e 0,1 mg / ml cicloheximida por filtro, e coloque em uma incubadora de 31 ° C. </li><li> Ligue o microscópio de microinjeção e definir sua fase aquecida a 39 ° C. Nós usamos um microscópio invertido (Axiovert 200, Carl Zeiss microfilmagem, Inc.) com uma fase aquecida, objetivos 10X e 32X, e um FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Por último, abra o tanque de gás nitrogênio, que abastece a mesa de ar com nitrogênio. </li><li> Diluir DNA com água filtrada (use filtro 0,2 m) para uma concentração final de 0,2 mg / ml em um volume total de 10 - 100 ul. Posteriormente, spin DNA em microcentrífuga Eppendorf a 13.000 rpm por 30 min. Remover parte superior e coloque em um novo tubo. Essa etapa assegura que quando você carrega o seu DNA diluído na agulha microinjeção você pode exatamente carga de DNA &quot;limpa&quot;. Seu DNA está agora pronto para microinjeção. </li><li> Prepare suas células tomando o primeiro filtro para fora de sua placa de cultura. Com uma lâmina cirúrgica (Blade Feather cirúrgica, aço inoxidável, n º 11), cortar o filtro do suporte do filtro e coloque em 5 ml, 39 ° C meios de crescimento quentes MEM acrescido de 50 mM HEPES (60 x 15 mm chapa). Pesar o filtro na placa de cultura com a lâmina cirúrgica que você usou para cortá-lo para fora. Colocá-la no tal filtro que o buraco da lâmina cirúrgica envolve o meio do filtro. Coloque sua placa de cultura para o palco aquecida do microscópio. </li><li> 2-3 mL de carga de seu DNA diluído (neste caso a codificação plasmídeos VSVGts045-GFP = controle de injeção simulada) em uma agulha microinjeção (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), torça a tampa protetora da agulha e deixá-lo cair no chão . Agora a agulha está pronto para ser parafusado em seu compartimento. Para isso, pressione a tecla menu do seu InjectMan e verifique se a válvula está desligado. Enrosque a agulha no respectivo suporte, cuidado para não estragar na agulha muito bem como isso pode levar à ruptura. Agora, pressione a tecla de menu novamente, o P aplicado c vai impedir a mídia de ser sugado para dentro da agulha durante o procedimento microinjeciton. Finalmente, toque o joystick para apagar homing armazenados. </li><li> Para diminuir a agulha para as células, use a objetiva de 10X e trazer a agulha para o feixe de luz acima do líquido. Agora concentrar-se nas células, trazer o foco para cima novamente, girando o anel de foco até 180 °, e encontrar a agulha. Posteriormente, mova lentamente a agulha em foco, em seguida, trazer de novo fora de foco (trabalhando para trazer as células para o foco de novo), derrubar agulha paracus novamente. Repita até que a agulha toca a superfície da mídia, altura em que tudo o que você vai ver é um halo. Quando você chegar a um ponto em que as células estão em foco, mas a agulha ainda é fuzzy (isto é, fora do plano focal) a mudança para o objectivo 32X e multa ajustes grossos. </li><li> Definir o z-limite tocando a membrana apical com a ponta da agulha e subtraindo cerca de 10 mM como os núcleos estão colocando cerca de 10 M abaixo da membrana apical. </li><li> Depois de definir o z-limite, encontrar a pressão de injeção direita. Iniciar a 95 PSI. Se a pressão for muito alta, suas células vão explodir. Se a sua pressão é muito baixa, você verá um ponto branco que se mantém, mas nada acontece. Com uma injeção bem sucedido, você vai ver uma mudança de fase sem alterar o tamanho da célula. Para a injeção, trazer a agulha de alguns microns fora do plano focal o mais rápido possível. Mire com a agulha acima do núcleo (ou seja, no meio de uma célula individual) e pressione o botão de injecção do seu joystick, mas não mantenha o botão pressionado. </li><li> 100-500 injetar células dentro do buraco de sua lâmina cirúrgica que se encontra em suas células. Quando você terminar, coloque as suas células com a placa de cultura e lâmina cirúrgica em uma incubadora de 39 ° C, e incubar por 2 h. Durante este tempo, VSVGts045-GFP é expressa e secretada no ER. No entanto, a 39 ° C, VSVGts045-GFP não pode dobrar corretamente e, portanto, não pode deixar o ER. Enquanto isso, a pequena GTPase de interesse irá acumular no citosol em co-injeção de experimentos. </li><li> Após 2 h, coloque o seu células em 1 ml de mídia crescimento MEM acrescido de 50 mM HEPES e 0,1 cicloheximida mg / ml em uma placa de 12 poços e incubar por 2 horas a 31 ° C. Durante este período de perseguição, VSVGts045-GFP irá dobrar corretamente, deixam o ER e é entregue à superfície da célula. </li><li> Repita os passos 3,1-3,10 para filtros dois (injetar plasmídeos codificando VSVGts045-GFP e, por exemplo V5-tagged Rab13T22N) e três (injetar plasmídeos codificando VSVGts045-GFP e, por exemplo V5-tagged Rab13Q67L). Cada injeção demora cerca de 20-60 min. No entanto, é absolutamente crucial para o tratamento de todas as maneiras o mesmo filtro em todo o incubações de temperatura e mudança de coloração da superfície até que você corrigir as células. Após a fixação, você pode executar o resto do seu protocolo de coloração para todos os filtros, ao mesmo tempo. </li></ol> 4. A coloração da superfície de Análise de imunofluorescência Note, a fim de evitar o branqueamento do sinal da GFP VSVGts045-GFP, proteger espécies de luz, cobrindo com papel alumínio durante todos os procedimentos subseqüentes. <ol><li> Se você deseja executar manchas na superfície, coloque suas células em um prato de cultura em uma placa de metal no gelo e lave as células com 1X PBS gelado 2 + (PBS [0,2 g / litro KCl, 0,2 g / litro KH 2 PO 4, 8 g / litro de NaCl e 2,17 g / litro Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] mais 0,1 g / litro CaCl 2 e 0,1 g / litro MgCl 2 x 6 H 2 O). Posteriormente, coloque 30 mL de um anticorpo que reconhece a ectodomínio de sua proteína, neste caso, o anticorpo monoclonal de camundongo TK1 (IgG 1, obtidos a partir do final de Thomas Kreis), em parafilme limpa colocada sobre a placa de metal no gelo. Coloque o filtro com suas células de cabeça para baixo sobre a queda e adicione algumas gotas de anticorpos para a parte de trás do filtro. Incubar por 1 hora no gelo. </li><li> Células colocar em uma placa de 12 poços, lave 3X com PBS gelado 2 + (ou RT quente PBS 2 + sem coloração da superfície antes), e corrigir com paraformaldeído a 3% por 15 min em temperatura ambiente. </li><li> Lave as células uma vez com PBS 2 + e deixar em PBS + 2 por 5 min. </li><li> Incubar as células no bloqueio / buffer permeabilização (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] saponina em PBS 2 +) com 10% [vol / vol] soro de cabra. Incubar 1 h em temperatura ambiente. </li><li> Diluir anticorpos primários para detectar a expressa Rab GTPase, neste exemplo anti-V5 (mouse anticorpo monoclonal IgG 2a, Invitrogen), 1:200 na BPB. Spin-anticorpos diluídos em uma microcentrífuga Eppendorf por 10 min a 13.000 rpm. ML lugar 30 da solução de anticorpos em parafilme limpa colocado em uma câmara úmida. Coloque as células no filtro de cabeça para baixo sobre a queda de anticorpos e incubar por 1 h em temperatura ambiente. </li><li> Células lugar de volta (até o lado direito) em uma placa de 12 poços e lavar 5X mais de 30 min com BPB na RT. </li><li> Diluir apropriado anticorpos secundários, neste caso de cabra anti-IgG de rato 1 Alexa 594-rotulados (para detecção de VSVG na superfície, Invitrogen), e Cy5 marcado com anticorpos secundários para reconhecer o seu GTPase Rab, neste exemplo de cabra anti-IgG de rato 2a Cy5-rotulados (ImmunoResearch Jackson), 1:200 em BPB e girar como acima. Coloque 30 mL de solução de anticorpos em parafilme limpa em câmara úmida e células lugar na cabeça de filtro para baixo sobre a queda de anticorpos. Incubar 1 h em temperatura ambiente. </li><li> Repita o passo 4.6. </li><li> Dip células em filtro de 3X em água deionizada e coloque racima do lado ight para microslides. Adicionar 10-15 mL de montagem (10% [wt / vol] DABCO, 50% [wt / vol] glicerol em água destilada) na parte superior das células. Lugar 18X18 milímetros tampa de vidro micro em cima e usando tecidos faciais pressione suavemente a tampa de vidro para a micro células. Seal com unha polonês. </li><li> Analisar amostras com um microscópio confocal. Usamos um Microsystem LSM 510, Carl Zeiss microfilmagem, Inc. que foi equipado com uma lente de 63X de imersão em água. </li><li> Para a preparação das figuras, ajustar e combinar imagens utilizando programas como o Adobe Photoshop e Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Resultados representante Para exemplos de como a co-expressão de GTPases pequenas interfere com a classificação VSVG gentilmente referem-se a artigos publicados para qualquer missorting apical 3, 4 ou inibição de entrega de superfície 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Na injeção simulada, ou seja, uma injeção de codificação apenas o plasmídeo VSVGts045-GFP, a proteína é entregue à superfície basolateral de bem-polarizada células MDCK, a julgar pela coloração de superfície (em vermelho, Figura 1 A). Note que nem todos os VSVGts045-GFP é entregue à membrana basolateral durante a perseguição a 31 ° C como evidenciado pelo sinal extensa intracelular para a proteína total (em verde, Figuras 1 A e B). Em células que não são bem-polarizada VSVGts045-GFP será entregue também à membrana apical (Figura 1 B). Se as amostras de seu controle parecido com o celular na Figura B 1, você não pode confiar seus dados e tem que repetir o experimento com melhor polarizado células. Barras de escala são 5 mm.

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os passos mais críticos para um experimento de microinjeção de sucesso são a qualidade ea pureza do DNA e da polaridade de suas células. Sem células polarizadas, o seu controle de injeção já terá mistargeted VSVG eo experimento não pode ser usado. Se o DNA é de má qualidade, o DNA pode entupir a agulha de injeção levando a pouca ou nenhuma expressão da proteína desejada de todo. Além disso, é aconselhável a utilização de plasmídeos de expressão que são conhecidos por levar a níveis de alta expr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Axiovert 200 microscópio com estágio de aquecimento </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Ordem personalizada </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 micromanipulador FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> Ordem personalizada </td></tr><tr><td> Femtotips II (agulhas microinjeção) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader dicas </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Claro de 12 mm transwell filtro suporta </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxina livre kit maxiprep plasmídeo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Células epiteliais polarizar sua membrana plasmática em bioquímica e funcionalmente distintos domínios apical e basolateral onde o domínio apical enfrenta o &#39;livre&#39; e superfícies da membrana basolateral é em contato com o substrato e as células vizinhas. Ambos os domínios de membrana são separados por junções apertadas, que formam uma barreira de difusão. Apical-basolateral polarização pode ser reproduzido com sucesso na cultura quando as células epiteliais como Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), as células são semeados em altas densidades, em filtros de policarbonato e cultivados por vários dias 1 2. Estabelecimento e manutenção da polaridade celular é regulada por um conjunto de pequenas GTPases da superfamília Ras, como Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 e Rab13 3 4 5 6 7. Como todas as GTPases ciclo dessas proteínas entre um estado PIB-bound inativos e um estado GTP-bound ativo. Mutações específicas nas regiões de ligação de nucleotídeos interferir com esta bicicleta 8. Por exemplo, Rab13T22N está permanentemente bloqueado no PIB forma e, assim, apelidado de &quot;negativo dominante&quot;, enquanto Rab13Q67L já não pode hidrolisar GTP e é, portanto, trancado em um estado &quot;ativo dominante&quot; 7. Para analisar a sua função em células negativo dominante e dominante alelos ativos de GTPases são normalmente expressos em níveis elevados para interferir com a função das proteínas endógenas 9. Uma maneira elegante de alcançar altos níveis de superexpressão em um curto espaço de tempo é introduzir os plasmídeos que codificam as proteínas relevantes diretamente no núcleo das células cultivadas em polarizado filtro suporta o uso de técnica de microinjeção. Isso é muitas vezes combinada com a co-injeção de plasmídeos repórter que codificam os receptores da membrana plasmática que são especificamente classificadas para o domínio apical ou basolateral. A carga freqüentemente utilizado para analisar a carga de classificação para o domínio basolateral é um alelo sensível à temperatura da glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVGts045) 10. Esta proteína não pode dobrar corretamente a 39 ° C e por isso serão retidos no retículo endoplasmático (ER), enquanto a proteína reguladora de interesse é montado no citosol. A mudança para a 31 ° C, então, permitir VSVGts045 dobrar corretamente, deixam o ER e viajar para a membrana plasmática 11. Esta perseguição é geralmente realizado na presença de cicloheximida para prevenir a síntese de proteína ainda mais levando a resultados mais limpo. Aqui nós descrevemos em detalhe o procedimento de microinjecting plasmídeos em células polarizadas e incubações subseqüentes, incluindo mudanças de temperatura que permitem uma análise global das proteínas reguladoras envolvidas na triagem basolateral.

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Este artigo detalha os procedimentos envolvidos na análise da superexpressão e GTPases pequenas células epiteliais polarizadas utilizando a técnica de microinjeção.

Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.3K visualizações.  Northwestern University. Este artigo detalha os procedimentos envolvidos na análise da superexpressão e GTPases pequenas células epiteliais polarizadas utilizando a técnica de microinjeção.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Biologia

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Intranucleares microinjeção de DNA em Dissociated neurônios de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Geração de Transgênicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinjeção de embriões

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Estudando a expressão de proteínas durante o desenvolvimento de lentes de galinha

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

Autor em destaque: investigando o desenvolvimento e a função do cristalino por meio da microinjeção de retrovírus RCAS (A) em lentes embrionárias de galinha 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

Microinjeção de Retrovírus RCAS(A) Recombinante em Lentes de Galinha Embrionárias

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

Methods Article

Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais