Este trabalho foi financiado pela Universidade de Basel, Departamento de Biomedicina, eo Swiss National Science Foundation (31003A-116624).

1. Criação de culturas organotípicas cerebelo Cultura de lâminas cerebelares são preparadas a partir de 8 dias pós-natal filhotes P (8) do rato utilizando o método de incubação estática 10. Em nosso laboratório, nós usamos B6CF1 ratos. Em algumas experiências ratinhos transgénicos também foram utilizadas as quais expressam EGFP selectivamente nas células de Purkinje. A preparação de culturas fatia demora cerca de 30 minutos por rato filhote, ou seja, 3 horas para uma ninhada de seis filhotes de rato. Todos os passos são realizados sob condições estéreis em uma bancada de fluxo laminar, com instrumentos cirúrgicos esterilizados. <ol><li> O cerebelo do rato pups P8 é dissecado do cérebro em meio arrefecido com gelo preparação (MEM (Gibco catálogo No. 11012) com glutamax 1:100, pH 7,3), utilizando-se um estereomicroscópio. </li><li> O cerebelo é cortada em fatias grossas 350 mM na orientação sagital usando um cortador de tecidos McIlwain. </li><li> As fatias são colocadas em pastilhas de células de cultura (Millipore approx.6 fatias por pastilha, Millipore PICM03050) e são incubadas em placas de 6 poços com 0,75 ml por cavidade de meio de incubação (48,35 ml de MEM, 25 ml de Eagle Medium, 25 ml de soro de cavalo, 1 ml glutamax I, 0,65 ml de uma de glicose estéril a 10% pH da solução, 7,3), numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C. Todos os reagentes de cultura de tecidos foram da Gibco, Invitrogen. </li><li> Os tratamentos farmacológicos são tipicamente iniciado aos 3 dias in vitro (DIV3) pela adição do fármaco na concentração desejada ao meio de cultura. Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ácido (RS) -3,5-di-hidroxifenilglicina (DHPG) eram de Tocris, RU. Uma vez que muitas drogas requer o uso de DMSO ou etanol para preparar uma solução-mãe (por exemplo, PMA), deve ser tomado cuidado de que a quantidade total de solvente adicionado ao meio de cultura não exceda 1% (7,5 uL por poço). As drogas são renovadas em conjunto com a mudança do meio de cultura a cada 2 ou 3 dias nd rd. </li></ol> 2. Fixação e Immunoscontendo de culturas organotípicas cerebelo Uma vantagem importante do cerebelo é que os anticorpos que especificamente são disponíveis e brilhantemente a mancha os neurónios cerebelares principais, ou seja, células de Purkinje e as células granulares. A morfologia dendrítica de células de Purkinje pode ser revelado por imunocoloração com anti-calbindina D28K. <ol><li> Para a fixação das culturas, o meio de cultura é removido e 3 ml de paraformaldeído a 4% frio, em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) são adicionados cuidadosamente por poço contendo o inserto Millicell com as fatias cerebelares ligadas à membrana. Culturas são fixadas durante a noite, em seguida, o fixador é removido e as culturas são lavadas com tampão de fosfato. </li><li> Para imunocoloração os anticorpos seguintes são usadas: de coelho anti-calbindina D-28K (Swant, Bellinzona, Suíça) a 1:1000 para visualizar selectivamente células de Purkinje e monoclonal anti-NeuN (Chemicon, Millipore) a 1:500 para visualizar selectivamente granucélulas le 12. Coelho anti-GFP foi de Abcam, UK. Anticorpos secundários fluorescentes Alexa eram de Molecular Probes, Invitrogen. </li><li> As culturas são permeabilizadas e bloqueada pela adição de soro de cabra normal, 3% + 0,3% de TritonX100 em tampão fosfato 0,1 M (solução bloqueadora). Anti-calbindina D28K e anti-NeuN são diluídas em solução de bloqueio e as culturas são incubadas com a solução de bloqueio contendo os anticorpos durante a noite a 4 ° C sob agitação ligeira. Todas as diluições são indicadas em% (v / v), Triton X-100 é tomada a partir de uma solução mãe a 10%, a fim de facilitar a pipetagem. </li><li> As culturas são lavadas 3x com tampão de fosfato 0,1 M e são, então, incubadas com anticorpos secundários apropriados, por exemplo, anticorpo de cabra anti-coelho Alexa 568 e de cabra anti-rato Alexa 488 diluído a 1:500 em tampão fosfato 0,1 M + 0,1% de TritonX100 durante 2 horas a temperatura ambiente. As culturas são então lavadas 3x com tampão de fosfato 0,1 M. </li><li> As fatias coradas são removidas a partir da culturabem com um pincel e são montadas em lâminas de vidro, mais Superfrost e lamela com um meio de montagem adequado, como por exemplo Mowiol. As culturas podem agora ser vistos em um microscópio comum com equipamentos de epifluorescência ou com um microscópio confocal. </li></ol> 3. Vendo de Células de Purkinje individuais em culturas fatia organotípicas <ol><li> Depois de imunocoloração com calbindina D28k citoplasma completa das células de Purkinje é brilhantemente manchadas incluindo os dendritos e axônio. Devido ao alinhamento denso de células de Purkinje na camada de células de Purkinje, os mandris dendríticas da maioria das células de Purkinje são sobrepostas tornando-o difícil de estudar o mandril completa de uma célula individual. No entanto, devido a morte celular de algumas células de Purkinje, durante o processo de preparação, em muitas culturas algumas áreas estão presentes com uma densidade reduzida das células de Purkinje. Em tais áreas, é possível encontrar as células de Purkinje com um mandril dendrítica completo, que não se sobrepõem a outros cells. Nestas células, o mandril dendríticas podem ser visualizados e analisados ​​com uma qualidade comparável a uma coloração de Golgi. Porque no cerebelo as células de Purkinje são o tipo de célula que expressa apenas calbindina D28K as células são também identificadas como células de Purkinje. </li><li> Um método alternativo é a utilização de culturas derivadas de B6; FVB-Tg (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J mice (aqui chamado Pcp2-EGFP ratos, disponível a partir de Jackson Laboratories) que expressam EGFP sob a célula de Purkinje promotor L7 específico 11. Em cultura de lâminas tais células vivas de Purkinje podem ser visualizadas por expressão de EGFP. É também possível seguir a morfologia dendrítica de uma única célula ao longo do tempo. Alternativamente, após a fixação, as células que expressam EGFP-Purkinje podem ser imunocoradas com um anticorpo anti-GFP. Ambos os métodos são adequados para a coloração de dendritos, corpos celulares e axónios de células de Purkinje em culturas organotípicas. Porque o promotor L7 nos ratos Pcp2-EGFP não é expresso em todas as células de Purkinje e existem variations na frequência de células que expressam de Purkinje no ratinho (Kapfhammer, dados não mostrados) cortar as culturas derivadas destes ratinhos tornar mais fácil visualizar e medir células de Purkinje, que têm árvores dendriticas que se sobrepõem com outras árvores dendriticas das células de Purkinje. Árvores dendriticas possam ser vistas individualmente, quando as células de Purkinje adjacentes com sobreposição de árvores dendriticas não expressam GFP (Figura 1A, B). </li></ol> 4. Medição de Purkinje tamanho da árvore de células dendríticas e pontos de ramificação <ol><li> Tamanho da árvore dendrítica. Com a marcação fluorescente de células de Purkinje do tamanho da árvore dendrítica de uma dada célula pode ser facilmente medido se a árvore não se sobrepõe com outras células. Uma vez que as etiquetas calbindina imunorreatividade todas as células de Purkinje, que pode ser difícil de identificar células com não-sobreposição árvores dendriticas. Neste caso, a utilização do Pcp2-EGFP é recomendado para simplificar a identificação das células de Purkinje suficientes com que não se sobrepõem árvores dendríticas. Uma vez que uma célula de Purkinje com uma árvore sem sobreposição dendríticas é identificado, ele é visto com a lente de 20x e uma imagem é gravada com uma câmera digital. Essa imagem pode ser analisada com um programa de análise de imagem. Usamos Image Pro Plus, que permite traçar a árvore dendrítica da célula com um único clique do mouse usando a ferramenta varinha mágica no modo de medição (Figura 2A). O programa então calcula a área coberta pela árvore dendrítica e exporta para o MS Excel. A análise estatística dos dados é feita com o software GraphPad Prism (ver abaixo). </li><li> Número de pontos de ramificação. Devido à morfologia altamente ramificada e fina das células dendriticas Purkinje pontos de ramificação da árvore precisam ser contado manualmente. O arquivo de imagem de 20x das células de Purkinje é ampliada tal que cobre a maior parte da tela usando o Adobe Photoshop. Em seguida, cada ponto de ramificação é contado e marcado com um ponto brilhante (Figura 2B). </li></ol> Monitorização do desenvolvimento da árvore de células dendríticas durante o período de Purkinje cultura Culturas organotípicas de fatias derivados Pcp2-EGFP ratinhos que expressam EGFP especificamente em células de Purkinje permitem estudar a morfologia das células individuais durante vários dias em cultura. Deste modo, o crescimento e desenvolvimento da árvore dendrítica durante o período de cultura pode ser muito bem documentada. Vivendo células identificadas Purkinje foram fotografados todos os dias rd 2 ª ou 3 durante o período de cultura, com o objetivo de 10x. Este objectivo poder baixa foi escolhida para evitar e minimizar os danos para as células de fototoxicidade devido à iluminação com luz fluorescente. Figura 3 mostra dois exemplos de células de Purkinje fotografadas em culturas vivas. A primeira célula foi seguido de 2 dias in vitro até 7 dias in vitro (Figura 3, AC). É evidente que o dendritic árvore da célula durante este período de tempo se vários novos ramos e se expande em tamanho. No segundo exemplo, uma célula de Purkinje foi seguido 4-11 dias in vitro (Figura 3, DF). A árvore dendrítica pequeno presente em DIV4 expande substancialmente durante este período de tempo. Ambos os exemplos demonstram que a maior parte da árvore dendrítico das células de Purkinje apresentam no final do período de cultura, de fato, desenvolver-se na cultura. Desenvolvimento da árvore Purkinje célula dendrítica é inibida por PKC ou mGluR1 estimulação Culturas organotípicas do cerebelo foram cultivadas durante 11 dias. Começando no dia 2 ª in vitro, algumas das culturas foram tratadas com PMA (50 nM), um éster de forbol estimulante PKC ou DHPG (10 uM), um agonista do mGluR1, até que as culturas foram fixadas. Ambos os compostos foram mostrados anteriormente para inibir e limitar o crescimento de células dendríticas Purkinje 7, 8, 9, 5.No controlo não tratado de células de Purkinje fatias desenvolvido uma grande árvore e altamente ramificado dendrítica típica que foi visualizada quer por anti-calbindina imunomarcação (Figura 4A), ou em culturas com células expressando EGFP Purkinje, por imunocoloração com anti-GFP (Figura 4D). Em culturas tratadas com PMA a morfologia da árvore dendrítica alterou-se profundamente. Os dendritos apareceu espessada e tinha apenas poucos ramos laterais curtos. Muitas células de Purkinje, ao contrário das culturas de controlo, não eram mais unipolar, com um dendrito primário que emana do corpo da célula, mas desenvolveu dois ou mesmo mais dendrites primárias (Figura 4B, E). O território abrangido pela árvore dendrítica foi marcadamente reduzida (ver abaixo). Uma situação semelhante estava presente em culturas tratadas com DHPG. A árvore dendrítico das células de Purkinje foi grandemente reduzida em tamanho e a ramificação foi marcadamente reduzida (Figura 4C, F). No entanto, houve também alguns qualitative diferenças em comparação com culturas tratadas com PMA. Não houve aumento da espessura das ramificações dendríticas, e as dendrites primárias realizadas muitas dendrites secundários muito curtos (Figura 4C, F), sugerindo que os eventos de sinalização acontecendo em PMA e células de Purkinje DHPG-tratados podem ser similares, mas não idênticas. A avaliação quantitativa de Purkinje tamanho da árvore de células dendríticas e os pontos de ramificação para avaliação quantitativa, o tamanho da célula de Purkinje árvore dendrítica e o número de pontos de ramificação por célula de Purkinje é medido como descrito acima. Os resultados de pelo menos três experiências independentes são agrupados juntos, e um mínimo de 20 células necessitam de ser analisados. A média da área coberta pelas árvores dendríticas para as experiências de controlo, é determinada e estabelecida como 100%, e os valores para as outras experiências são expressos como valores de percentagem em conformidade. A análise estatística dos dados é feita com o software GraphPad Prism. Porque não fazerassumir que todos os valores determinados são parte de uma distribuição de Gauss, usamos testes estatísticos que não assumem tal distribuição dos valores medidos. Para comparar as condições de múltiplas e teste de significância estatística, usamos Kruskal-Wallis seguido de um procedimento adequado para testes post hoc para classificação baseados em estatísticas, como, por exemplo, implementado em teste de Dunn post no GraphPad Prism. Os resultados são normalmente apresentados como gráficos de barras. Um exemplo deste tipo de avaliação uma estatística é dada na Figura 5. Tanto a análise do tamanho da árvore dendrítica (Figura 5A) e o número de pontos de ramificação por célula de Purkinje (Figura 5B) mostram diferenças evidentes entre a condição de controle e tratamento DHPG ou PMA. Ambos os parâmetros foram diferentes, com uma significância estatística de p &lt;0,001 de acordo com o teste de Kruskal-Wallis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> Figure 1. EGFP-rotulados células de Purkinje. Em Pcp2-EGFP ratos não todas as células de Purkinje expressa EGFP. Portanto, as árvores dendriticas das células de Purkinje algumas podem ser vistas individualmente, quando eles expressam EGFP (EGFP canal em A) e as células de Purkinje adjacentes com sobreposição de árvores dendriticas não (negativa no canal de EGFP mostrado em A, positivo na coloração anti-calbindina mostrado no canal de vermelho em B). Barra de escala = 50 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> A Figura 2. Medição dos parâmetros dendríticos de células de Purkinje. (A). O tamanho da árvore dendrítica pode ser facilmente medida, traçando o contorno da célula de Purkinje com um único clique do mouse na imagem Image Pro software de análise mais usando a ferramenta varinha mágica. A ferramenta varinha mágica é usada de tal forma que a árvore dendrítica inteiro, incluindo a soma das células e todos os ramos dendríticas são completamente cercada pela linha. (B). O número de pontos de ramificação é counted manualmente em imagens de células de Purkinje. Cada ponto de ramificação é marcado com um ponto amarelo. Barra de escala = 50 um. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> Figura 3. Acompanhamento do desenvolvimento da árvore Purkinje célula dendrítica. Células de Purkinje foram fotografados Identificados repetidamente para monitorizar o crescimento da árvore dendrítica. (AC): árvore dendrítica de uma célula de Purkinje crescimento e desenvolvimento desde o primeiro dia in vitro (DIV) 2 até DIV7. Há um crescimento contínuo e ramificação dos dendritos durante este período de cultura. (DF): árvore dendrítica de uma célula Purkinje crescimento e desenvolvimento de DIV4 até DIV11. A árvore dendrítica expande substancialmente durante o período de cultura. Barra de escala = 50 um. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> Figura 4. Desenvolvimento da árvore Purkinje célula dendrítica é inibida por PKC ou stimulati mGluR1em (A), (D):. células de controlo não tratadas com uma árvore dendrítica bem desenvolvida. (B), (E): Depois de 9 dias de tratamento com PMA dendrites aparecer espessada e a árvore dendrítica é fortemente reduzido em tamanho. Células muitas vezes perdem a sua polarização e tornar-se bipolar (E). (C), (F): Depois de 9 dias de tratamento DHPG a árvore dendrítica é grandemente reduzida em tamanho. Ao contrário do tratamento PMA, muitos ramos laterais muito finas e curtas estão presentes nas dendrites primárias e secundárias. Células muitas vezes perdem a sua polarização e tornar-se bipolar (F). As células de Purkinje foram visualizadas por imunocoloração anti-calbindina em (A - C) e por EGFP-expressão em culturas derivadas de Pcp2-EGFP em ratos (D - F). Barra de escala = 50 um. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> Figura 5. Avaliação quantitativa de Purkinje tamanho da árvore de células dendríticas e ramificação. Medições quantitativas mostram que tanto o tamanho da árvore dendrítica (gráfico barra superior) e do number de pontos de ramificação (gráfico inferior bar) são muito reduzidos após o tratamento de PMA ou DHPG. As diferenças entre as árvores de controlo dendríticas e árvores dendriticas das células de Purkinje de culturas tratadas foram significativas com p &lt;0,001.

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	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death.">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li><li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-&#954;B+signaling.">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-&#954;B signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li><li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li><li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C?-deficient+mice.">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li><li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva Europeia Conselho Comunidades, de 24 de Novembro de 1986 (86/609/CEE) e foram analisados ​​e autorizados pelas autoridades suíças. Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos aqui apresentados permitem estudar Purkinje desenvolvimento de células dendríticas em culturas organotípicas do cerebelo e avaliar quantitativamente a expansão de células dendríticas Purkinje, medindo o tamanho da árvore dendrítica e o número de pontos de ramificação dendríticas. Naturalmente, uma análise mais completa e quantitativas sofisticadas de dendrites de células de Purkinje é possível, por exemplo, através da determinação comprimento dendrítico total, realizando uma análise de S...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Insere cultura de tecidos </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> Os PICMORG50 pastilhas têm uma borda baixa e permitir a exibição de culturas vivas em um microscópio </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medum Águia </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cavalo </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol 12-myristate 13-acetato (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-di-hidroxi-fenil-glicina (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-calbindina D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Anti NeuN, clone A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

As células de Purkinje são um sistema de modelo atractivo para estudar o desenvolvimento dendrítico, porque têm uma árvore dendrítica impressionante, que é estritamente orientadas no plano sagital e desenvolve principalmente no período pós-natal, em pequenos roedores 3. Além disso, os anticorpos que estão disponíveis várias células de etiquetas selectiva e intensa de Purkinje, incluindo todos os processos, com anti-calbindina D28K sendo a mais amplamente utilizada. Para visualização dos dendritos em células vivas, os camundongos que expressam EGFP seletivamente nas células de Purkinje 11 estão disponíveis através Jackson laboratórios. Organotípicas culturas de células cerebelares fatia permitir a manipulação experimental fácil de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas, porque a maior parte da expansão da árvore dendrítica de células dendríticas Purkinje realmente está ocorrendo durante o período de cultivo 4. Apresentamos aqui um protocolo curto, confiável e fácil de visualizar e analisar a morfologia dendrítica de células de Purkinje crescido em organotypic cerebelares culturas fatia. Para muitos fins, uma avaliação quantitativa da árvore dendrítica célula de Purkinje é desejável. Nós nos focamos em dois parâmetros, o tamanho da árvore dendrítica e números de ponto de desvio, que pode ser rápida e facilmente determinados a partir de anti-calbindina manchadas culturas fatia do cerebelo. Estes dois parâmetros produzir uma medida fiável e sensível de mudanças da árvore de Purkinje de células dendríticas. Utilizando o exemplo de tratamentos com a proteína-quinase C (PKC) e PMA activador do receptor de glutamato metabotrópicos 1 (mGluR1) é mostrado como as diferenças no desenvolvimento dendríticas são visualizadas e quantitativamente avaliados. A combinação de a presença de uma árvore dendrítica extensa, métodos selectivos e imunorreatividade intensa, as culturas organotípicas de fatias que cobrem o período de crescimento dendrítico e um modelo de rato com Purkinje expressão EGFP célula específica tornar as células de Purkinje de um sistema poderoso modelo para revelar os mecanismos de dendritic desenvolvimento.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Apresenta-se um protocolo que permite visualizar e para avaliar quantitativamente a morfologia da árvore dendrítico das células de Purkinje individuais crescidas em culturas organotípicas do cerebelo. Este protocolo destina-se a promover estudos sobre os mecanismos de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas.

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

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Research

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Neuroscience

18.5K visualizações.  University of Basel. Apresenta-se um protocolo que permite visualizar e para avaliar quantitativamente a morfologia da árvore dendrítico das células de Purkinje individuais crescidas em culturas organotípicas do cerebelo. Este protocolo destina-se a promover estudos sobre os mecanismos de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas.

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Neurociência

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...