Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association (BGIA 7.850.037 para Beiyan Dr. Zhou).

1. Isolamento de Células de Medula Óssea <ol><li> Isolar fêmur e dos ossos da tíbia 6-8 semanas de idade, enxaguar o cabelo e, em seguida, cortado o osso. </li><li> Use uma agulha de 21G e seringa de 10 ml para expulsar medula em frio PBS 2% inactivado pelo calor soro fetal bovino (FBS) (3-5 ml / mouse). </li><li> Passa medula através de uma agulha 21G 4-6 vezes para dissociar as células. </li><li> Passa células através de um coador de 70 mM para remover aglomerados de células, células ósseas, cabelo e outras células / tecidos. </li><li> Adicionar 3 volumes de solução de NH4CI (solução de NH 4 Cl, Stemcell Tecnologia 0,8%), e incubar em gelo durante 10 min para remover os glóbulos vermelhos. </li><li> Girar as células a 500 xg por 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em PBS frio 2% de FBS (20-50 ml, dependendo da quantidade de células). </li></ol> 2. Indução Formação BMDM <ol><li> Ressuspender as células de medula óssea isoladas em meio de crescimento BMDM (2x10 6 células / ml). </li></ol> BMDM meio de crescimento: Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) + FBS a 10% + 15% de filtrado (0,2 um), L-929 de células (ATCC, CCL-1), sobrenadante de cultura (contendo monócitos factor estimulador de colónias, o M-CSF) ou 10 ng / ml M -CSF. Nota: L-929 contém sobrenadante celular M-CSF 18. Para assegurar a actividade eficaz do meio condicionado, 5 x 10 5 células L-929 foram semeadas em 2 frascos T75 cm por 6-7 dias, o meio condicionado é recolhido e passado através de um filtro de 0,45 um antes da utilização. Aliquotas de meio pode ser utilizado imediatamente ou armazenado em -80 ° C durante 1-2 meses. <ol start="2"><li> Células de sementes em placas de 6 ou 12 poços (de cultura de tecidos, dependendo do desenho experimental) (Corning Costar). </li><li> Alterar meio de crescimento BMDM fresco no dia 3. </li><li> No dia 7, a formação de BMDM madura é avaliada utilizando análise de citometria de fluxoe anticorpos conjugados com fluoróforo para detectar células que expressam CD11b e F4/80. </li></ol> 3. BMDM Ativação Polarizada <ol><li> No dia 7, mudar para meio de estimulação fresco: para a activação M1, utilizar IMDM contendo FBS a 10% e 100 ng / ml de LPS ou 100 ng / ml de LPS de 50 ng / mL de IFN-y, para a activação M2, utilizar IMDM contendo 10% de FBS com 10 ng / ml de IL-4 e / ou 10 ng / ml de IL-13. </li><li> Recolhe BMDMs estimuladas por separá-las a partir do prato quente usando tripsina a 0,05%, seguido por lavagem das células duas vezes com PBS contendo 10% de FBS. </li></ol> Nota: Para separar e voltar a suspender os macrófagos maduros, após diferenciação, solução de tripsina a 0,05% (contendo EDTA 0,48 mM, Invitrogen) ou 2-5 mM em EDTA-Ca e Mg livre de PBS ou tampão de equilibrada de Hank (HBSS) pode ser usado. Quando utilizando o meio digestivo contendo tripsina, as células são tratadas a 37 ° C durante menos de 10 minutos para evitar a perda de surcara proteínas devido ao excesso de digestão. <ol start="3"><li> Utilização de anticorpos para detectar a expressão de antigénios de superfície celular, incluindo a de CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ou CD86 em diferentes pontos de tempo, utilizando procedimentos de coloração de citometria de fluxo convencionais. </li><li> Determinar a expressão dos genes característicos de macrófagos M1 e M2 activados incluindo IL-1β, TNF-α e IL-6 (activação M1) ou IL-10, IL-13, arginase1 e PPARy (activação M2) utilizando qRT-PCR. Determinar a activação de vias de sinalização celular envolvidas na ativação dos macrófagos M1 ou M2 por Western blotting. </li></ol>

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	<li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis.">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li><li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization.">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. 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W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance.">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li><li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+metabolism+and+pgc-1[beta]+attenuate+macrophage-mediated+inflammation.">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. 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A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties.">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li><li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism.">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li><li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+regulator+of+macrophage+activation:+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation.">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li><li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation.">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li><li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity:+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation.">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li><li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor.">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li><li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets:+Cancer+as+a+paradigm.">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+In+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos aqui um processo simples e facilmente adaptável in vitro para induzir a activação dos macrófagos derivados de células progenitoras da medula óssea. Este procedimento pode ser utilizado para a investigação dos mecanismos responsáveis ​​pela polarização dos macrófagos. A pureza dos macrófagos maduros obtidos utilizando este protocolo médias de 95-99%, e não há procedimentos de purificação adicionais são necessários. Para investigar a função de genes específicos de interesse ...

Distinta de respostas inflamatórias clássicos, macrófagos que infiltram os tecidos muitas vezes exibir o status de ativação polarizada que desempenha um papel crucial na regulação das funções fisiológicas do tecido hospedeiro 1-8. Após a estimulação, a ativação dos macrófagos podem ser classificados em clássico (M1) e alternativos (M2) a ativação 2, 4, 9. M1 activação macrófago depende receptores do tipo Toll (TLR) e a activação do factor nuclear kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal quinase 1 (JNK1), levando à produção de citoquinas inflamatórias, tais como TNF-e IL-α 1β e activação da iNOS, que resulta num aumento da produção de espécies de oxigénio reactivas, como o óxido de nitreto de (NO), 10, 11. Em contraste, os macrófagos M2 recrutas activação de PPARy, PPARô, ou IL-4-STAT6 caminhos, conduzindo a, anti-inflamatórios activação alternativa (M2), que está associado com a sobre-regulação do receptor de manose de CD206, e arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 &lt;/ Sup&gt;. Macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) apresentam um ideal modelo in vitro para entender os mecanismos que controlam a polarização de macrófagos ativados 15. Especificamente, a activação de macrófagos M1 pode ser induzida por lipopolissacáridos (LPS) de estimulação, enquanto M2 polarização de macrófagos pode ser induzida por IL-4 e / ou IL-13. Osso maduro macrófagos derivados da medula e macrófagos activados podem ser identificados através de análise de citometria de fluxo para a expressão de antigénios de superfície, incluindo CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 9, 16, 17. Além disso, as alterações na produção de citoquinas e as vias de sinalização celulares associados com a polarização de macrófagos pode ser medida por RT-PCR quantitativo e Western blotting, respectivamente. Em resumo, rato macrófagos derivados de medula óssea pode servir como um modelo relevante para estudar a polarização de macrófagos in vitro.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IMDM</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30259.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10438-026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Murine GM-CSF</td>
 <td>PeproTech</td>
 <td> 315-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4Cl</td>
 <td>StemCell Technologies</td>
 <td>7850</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-929</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CCL-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70 &mu;m cell strainer</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>352350</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x PBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>AP-9009-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b-APC</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>17-0112-81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse F4/80-FITC</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>11-4801-81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD69-PE</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>12-0691-81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD86-PE</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>12-0862-81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P3566</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages

O artigo descreve um prontamente adaptável fácil modelo in vitro para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.

Uma descrição esquemática do procedimento BMDM geração é apresentada (Figura 1). Alta pureza dos macrófagos maduros podem ser observados no dia 7, quando eles representam 95 a 99% das células CD11b + F4/80 + (Figura 2). Macrófagos polarizados podem ser examinados usando anticorpos contra CD11b, F4/80, CD11c e CD206 seguido por análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 3, os macrófagos M1 são detectados como F4/80 + CD11b + CD11c-CD206 células ...

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

O artigo descreve a adaptação prontamente fácil<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

investigation-macrophage-polarization-using-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

65.5K visualizações.  Texas A&M University. O artigo descreve a adaptação prontamente fácil In vitro Modelo para investigar a polarização de macrófagos. Na presença de GM-CSF/M-CSF, as células estaminais / progenitoras hematopoiéticas da medula óssea são dirigidos para diferenciação monocítica, seguido por estimulação M1 ou M2. O status de ativação pode ser rastreado por mudanças em antígenos de superfície celular, expressão gênica e de vias de sinalização celular.