Este trabalho foi financiado pela Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia. Os autores gostariam de agradecer Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Alemanha) para o patrocínio deste manuscrito, Dr. Paolo Petrucciani (Departamento de Imuno-hematologia e serviço de transfusão, Hospital Lotti Pontedera, Pisa, Itália) para a prestação de buffy coats humanos e Prof Massimo Pasqualetti (Departamento de Biologia - Unidade de Biologia Celular e do Desenvolvimento, da Universidade de Pisa, Pisa, Itália) para a habitação a colônia mouse.

ÉTICA DECLARAÇÃO Amostras humanas e animais foram processados ​​de acordo com as diretrizes do Ministério da Saúde italiano, a lei 116/92 e da Directiva 86/609/CEE do Conselho Comunidades Europeias. 1. As culturas de células monócitos <ol><li> Culturas humanos THP-1 em células T-75 frascos contendo meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro humano, 50 U / ml de penicilina e 50 mg / ml de estreptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanol a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Culturas Dividir quando confluentes (a cada 3-5 dias). </li></ol> 2. Isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de Buffy Coats <ol><li> Antes de iniciar o protocolo de isolamento, preparar uma solução de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,2, 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,5% de albumina sérica bovina (BSA), a adição de 5 ml de BSA da solução para 95 ml de tampão de enxaguamento (1: 20 diluição). Degas o buffer e mantê-lo frio (2-8° C). IMPORTANTE: A não degas a reserva pode resultar em menos do que ideal resultados porque as bolhas podem bloquear a coluna isolamento (veja o passo 3.2). Nota: Anticoagulante citrato dextrose fórmula-A (ACD-A) ou citrato fosfato dextrose (CPD) pode ser usado em alternativa. Por outro lado, outras proteínas de albumina ou de soros provenientes de outras espécies pode substituir BSA. Não use tampões contendo Ca 2 + ou Mg 2 +. </li><li> Obter capa flogística de doadores saudáveis ​​(com idades entre 20-60 anos de idade). </li><li> Prepare 50 ml tubos cônicos de gradiente de densidade centrifugação. Determinar o número de tubos necessários para o processamento de sangue (cada tubo pode processar 35 ml de sangue diluído) e adicionar 15 ml de Ficoll-Paque em cada tubo vazio. </li><li> Dilui-se 8 ml de sangue com 24 ml de / BSA a solução de EDTA PBS / (1:4 diluição). </li><li> Camada cuidadosamente a solução diluída no topo do Ficoll-Paque (densidade = 1,077 g / ml) em cada um dos tubos de 50 mL cónicos. Não mistureo sangue e de Ficoll-Paque. IMPORTANTE: Para evitar a mistura do sangue e Ficoll-Paque, mantenha o tubo em um ângulo de 45 ° e camada da mistura de sangue lentamente. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 4 ° C. As células mononucleares (MNCs) permanecerá na interface plasma-Ficoll-Paque, enquanto granulócitos e eritrócitos de sedimentos devido à maior densidade na pressão osmótica de Ficoll-Paque. </li><li> Transferir as células de interfase (células mononucleares do sangue periférico, PBMCs) para um novo tubo de 50 ml cheio com PBS / BSA / EDTA e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com PBS / BSA / EDTA para remover as plaquetas. Girar a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cultura as células em completo RPMI-1640 com 10% de soro humano e antibióticos ou prosseguir para monócitos purificação. </li></ol> 3. Purificação de monócitos a partir de PBMC primária <ol><li> Isolar monócitos de PBMC por esférulas magnéticas separação usando Hum.um kit de isolamento de monócitos Pan: <ol><li> Passar as células através de uma malha de nylon de 30 um (filtros de pré-separação de 30 mm), para remover eventuais grumos celulares. </li><li> Determinar o número de células usando um hemocitômetro. </li><li> Suspensão de células de centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente (RT). Aspirar o sobrenadante completamente. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 30 ul de tampão de PBS / EDTA / BSA por cada 10 7 células totais. </li><li> Adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR por 10 7 células totais. </li><li> Adicionar 10 ml de Cocktail Biotina-Anticorpo por 10 7 células totais. </li><li> Misturar bem e incubar durante 5 min a 2-8 ° C. </li><li> Adicionar 30 mL de tampão por 10 7 células totais. </li><li> Adicionar 20 ul de microesferas anti-biotina por 10 7 células totais. </li><li> Misturar bem e incubar durante 10 min a 2-8 ° C. </li><li> Ressuspender 8 até 10 células em 500 ul de tampão de PBS / EDTA / BSA. </li></ol></li><li> Separ magnéticoção <ol><li> Assim que o número total de células, escolha uma coluna de MACS apropriado e MACS Separador (ver MACS Coluna folha de dados). </li><li> Colocar a coluna no campo magnético do separador MACS. </li><li> Prepare a coluna por lavagem com a quantidade apropriada de tampão de PBS / EDTA / BSA (colunas MS: 500 ul; colunas LS: 3 ml). Nota: As colunas são &quot;parada fluxo&quot; e não secam. </li><li> Aplicar a suspensão de células para dentro da coluna. Colete de fluxo contendo células não marcadas, o que representa a fração de monócitos enriquecido. </li><li> Lave coluna 3x com tampão PBS / EDTA / BSA (500 mL de MS e 3 ml para LS por lavagem). </li><li> Coletar as células não marcadas que passam, representando as células monócitos enriquecidos, e adicione ao fluxo através da seção 3.2.4. Nota: Lava-se a coluna por adição de alíquotas de tampão de PBS / EDTA / BSA apenas quando o reservatório está vazio da coluna. </li><li> (Opcional) Retirar a coluna doseparador e coloque-o em um tubo de coleta adequado. Pipetar o tampão na coluna (colunas MS: 1 ml; colunas LS: 5 ml). Lave imediatamente as células nonmonocyte magneticamente rotulados com firmeza empurrando o êmbolo para a coluna. </li><li> Cultura de monócitos em meio RPMI-1640 completo purificado com 10% de soro humano e antibióticos. </li></ol></li></ol> 4. A purificação do primário a partir de monócitos de sangue inteiro <ol><li> Purifica-se monócitos a partir de sangue total usando o kit de isolamento de monócitos de sangue inteiro, seguindo as instruções do fabricante. </li></ol> 5. Nanopartículas Internalização no sangue leucócitos e monócitos purificados <ol><li> Placa de 5 x 10 5 células / ml (1 ml / cavidade) das PBMC isoladas ou purificadas os monócitos CD14 positivos em uma placa de 12 poços. </li><li> Vortex FITC-SiO 2 nanopartículas solução estoque e ressuspender em meio completo a uma concentração de trabalho de 100 nM. </li><li> Adicionar 10 ul de nanop de trabalhosuspensão de artigo (100 nM) nas amostras tratadas para atingir uma concentração final de nanopartículas de 1 nM. Adicionar o mesmo volume de meio completo de controlos não tratados para cada poço. </li><li> Depois de 1 hr a internalização recolher as amostras em tubos de polipropileno de 1,5 ml e centrifugar para durante 3 minutos a 6000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se a pelete com 1 ml de tampão de corrida 3 min a 6000 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão de corrida. As células são agora pronto para a leitura, por citometria de fluxo. </li></ol> 6. Isolamento de culturas mista glial primárias (Veja Bertero et al. 7) 7. Repique uma cultura de células gliais Confluent Mista <ol><li> Lavar um frasco T-75, uma vez com 10 ml de PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), em seguida, adicionam-se 10 mL de Versene e incubar a 37 ° C durante 5-7 min. </li><li> Pipeta-se o sobrenadante para cima e para baixo várias vezes, de modo a separar as células da superfície do T-75 e dissolveragregados celulares. </li><li> Transferência da suspensão de células em tubos de polipropileno de 15 ml. Recolha uma pequena quantidade de suspensão celular para contagem das células com um hemocitómetro. </li><li> Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em uma concentração final de 5 x 10 5 células / ml em meio de cultura completo glial. </li><li> Placa de 0,5 ml / poço numa placa de 24 poços e deixar que as células se contentar com 2-4 horas antes do tratamento de nanopartículas. </li></ol> 8. Nanopartículas Internalização em Microglia <ol><li> Adicionar 500 ul de meio de cultura completo glial (para os controlos não tratados) ou 500 ul de uma suspensão 2x Rodamina-SiO2 nanopartículas em meio de cultura completo glial (para amostras tratadas) para cada poço. </li><li> Pipetar as células para permitir o destacamento das células nonrapid-aderente em pontos de tempo seleccionados e recolher em tubos de polipropileno de 2 ml. </li><li> Adicionar 500 mLde Versene a cada poço e incubar a placa a 37 ° C durante 5 min, em seguida, separar a fracção celular remanescente e recolher cada amostra com as correspondentes células nonadhering da etapa anterior. </li><li> Centrifugar as amostras durante 3 minutos a 300 xg à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão de corrida AutoMACS. </li></ol> 9. A coloração com CD11b-VioBlue <ol><li> Adicionar 10 ul de VioBlue-CD11b anticorpo humano / ratinho 100 ul de suspensão de células (razão 1:11) em tampão de corrida e incubar 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de corrida e misturar a suspensão de células. </li><li> Centrifugar cada amostra durante 3 minutos a 300 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100-150 mL de tampão de corrida. </li><li> Ler as amostras para o citómetro (armazenar as amostras a 4 ° C entre os dois últimos passos). IMPORTANTE: antes de analisar as amostras, proceder à compensação da sobreposição de sinais iOs espectros de emissão n observada entre diferentes fluorocromos (nanopartículas ou anticorpos fluorocromo-conjugados). </li></ol> 10. Derramamento espectral sobre Compensação <ol><li> Abra a caixa de &quot;Configurações do instrumento&quot; (presente em todos os programas de software de instrumento). Nota: Se estiver usando um instrumento diferente do relatado na tabela de materiais, por favor consulte o manual específico instrumento para os detalhes da aquisição. </li><li> Adquirir amostra não tratada (sem nanopartículas) em baixa velocidade fluídico (se permitido pelo instrumento). Durante a aquisição, ajustar manualmente para a frente eo lado de dispersão (FSC e SSC, respectivamente), regulando os canais de tensão. Nota: Modificar as escalas dos eixos SSC e FSC, a fim de melhor visualizar a população de células completo na trama. Um instrumento definir modelo para cada tipo de célula de interesse pode ser criado, salvo e usado para futuras aquisições. </li><li> Abra o específicoSeparador &quot;região&quot; no software. Desenhe uma região grande apropriada (&quot;gate&quot;) em torno da população desejada. Nota: Internalização de nanopartículas induz uma mudança SSC das células. Se a porta é muito estreita restrito em torno da população de células de interesse, os dados adquiridos provavelmente vai perder parte das células a serem detectados. </li><li> Use duas amostras não coradas, um para uso como amostra em branco e uma de indemnização contra coloração PI (opcional), um single-coradas amostra com o fluorocromo apropriado para cada canal de fluorescência para ser compensado. Nota: Utilizar um tubo de 1,5 ml de amostra diferente para cada um dos anticorpos conjugados com fluorocromos para ser utilizada na rotulagem experimento. </li><li> Abra a aba &quot;Compensação&quot; na caixa &quot;Configurações do Instrumento&quot;. Aumentar ou diminuir o fator de compensação durante a aquisição até a intensidade de fluorescência no canal spillover é mais ou menos o mesmo para o pos fluorocromotivo e da população negativa. </li><li> Adquirir amostras tratadas com nanopartículas após a compensação foi ajustado. </li></ol>

<ol>
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Os autores declaram que Miltenyi Biotech GmbH patrocinou a apresentação deste manuscrito. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) é um nanotecnologia spin off da empresa surgiu a partir de IIT.

O protocolo experimental apresenta pontos muito importantes a serem levados em conta. É muito importante para o trabalho a 4 ° C (em gelo) e, possivelmente, no escuro, durante todas as etapas de coloração, porque temperaturas mais altas e as luzes podem afectar negativamente o rendimento de coloração. Nanopartículas pode ser sonicada para ser melhor ressuspenso imediatamente antes da utilização. Um fluxo correto citometria análise requer uma calibração correta nos diferentes canais. A calibração do instrumento deve ser realizada antes de cada sessão experimental. Além de problemas técnicos com a instrumentação, não pode haver também problemas com a rotulagem de anticorpos. É obrigatório para utilizar o anticorpo numa concentração apropriada. Se a concentração é muito alta ou muito baixa, a intensidade de sinal de insatisfação pode ser a conseqüência. As desvantagens desta preocupação técnica, a necessidade de trabalhar com amostras monodispersas, à incapacidade de localizar olocal de origem do sinal (isto é, diferentes compartimentos celulares). Existem também algumas limitações na escolha de fluorocromos que ser utilizadas, em combinação: o comprimento de onda da excitação e as bandas de emissão tem de ser suficientemente separadas para permitir a sua medição apropriado. Se os espectros de anticorpos utilizados sobrepõem, é necessária uma compensação correcta. A citometria de fluxo é um método poderoso para a análise de células, na presença ou ausência de nanopartículas. Esta técnica permite um estudo multiparamétrica de uma célula, um grande número de eventos analisados, rapidez de análise (mais de 1000 células / seg), reprodutibilidade e leituras estatísticos. As amostras podem ser processadas sem perder a viabilidade celular. Usando nanopartículas marcados com fluorescência é possível qualificar e quantificar a sua internalização em subpopulações de células, que são identificados por meio de marcadores específicos expostos na membrana celular. Parâmetros celulares podem mudar em presença de s<html> nanopartículas ESPECÍFICAS. Dependendo do objectivo da pesquisa, estas variações podem ser utilizadas para identificar um fenómeno específico, tal como espalhamento lateral das células que, proporcionalmente, aumenta com o aumento da taxa de internalização de nanopartículas. Modificações induzidas por nanopartículas de superfície celular também pode representar uma limitação da técnica. Por esta razão, o volume de receptores de membrana celular deve ser sempre levada em consideração e, possivelmente, conhecida com antecedência, para caracterizar com precisão a população de células de interesse. Deficiências extremas de membrana de osmose em amostras de nanopartículas sobrecarregado pode levar à morte da célula. Nanomaterial toxicidade dependente da dose deve ser empiricamente testados para cada população de células. Células mortas bem definido devem ser excluídos da quantificação de fluorescência. Por exemplo, a coloração de anexina V / PI é um dos vários métodos geralmente utilizados para detecção de células tanto em necrose e apoptose. &quot;&gt; Células primárias expressando GFP são também uma ferramenta poderosa para selecionar uma determinada subpopulação de células e coletar dados sem prelabeling. A combinação com nanopartículas fluorescentes complementares permite uma quantificação muito rápido e precisa de interação célula-nanopartícula. Entrega da droga ou gene é pensado para ser melhorado no futuro, a aplicação de nanopartículas capazes de liberar uma carga específica de drogas em tecidos selecionados. Emprego de nanopartículas como moduladores específicos portadores de entrega e / ou imunes para farmacêutico requer o conhecimento do ambiente biológico (ou seja, por meio de citometria de fluxo) para estudar as interações célula-nanopartículas.

Nanomateriais são hoje inspirando o interesse de cientistas de vida para os potenciais aplicações para a biomedicina 1. Uma grande variedade de materiais inorgânicos e orgânicos podem ser utilizados para a produção de nanoestruturas com diferentes formas físicas, e características químicas. Entre essas estruturas, nanopartículas de forma esférica demonstrado grande potencial para a medicina diagnóstica e de translação 2. O seu núcleo e design de superfície são movidos por uma possível aplicação e implica um estudo profundo de respostas das células-alvo após o contato de nanopartículas e interação. As nanopartículas que são pensados ​​para ser administrado deliberadamente a seres humanos vai entrar em contato direto com vários tipos de células do sistema imunológico. A sua responsabilidade de manter a integridade do corpo torna um tema crucial da investigação em nanomedicina 3. A parte celular do sistema imunológico inato é representada principalmente por phagocitos. Entre eles, a linhagem dos monócitos / macrófagos, células derivadas, incluindo as microglia residentes no sistema nervoso central, desempenha um papel fundamental na defesa imunológica 4,5. Eles são capazes de desencadear respostas de protecção dentro de poucas horas após encontrar com corpos estranhos. Além disso, coordenar as células monocíticas e instruir a resposta imune adaptativa por meio da liberação de citocinas. Todos estes acontecimentos ocorrem mesmo na presença de materiais fabricados, os quais são em grande parte percebidos como &quot;não-eu&quot; pelo sistema imunitário 6. Entre os métodos historicamente utilizados em imunologia para análise das células, citometria de fluxo representa uma das ferramentas mais poderosas. Além disso, a disponibilidade de tecnologias para a identificação ou purificação de uma subpopulação específica imune (geralmente explorando a exclusão ou a presença de uma única proteína de membrana) permite uma investigação exacta dos efeitos de um determinado nanopartículas em que ce primário especialll tipo 7. No entanto, as células podem apresentar alterações fisiológicas e morfológicas após exposição a nanopartículas. Além disso, as nanopartículas podem interferir com os parâmetros ópticos específicos, tais como a absorção ou emissão de luz em comprimentos de onda definidos, influenciar os resultados obtidos 8. Assim, os limites de utilização e eventuais adaptações de ensaios imunológicos clássicos para o estudo de novos materiais devem ser considerados. Este trabalho refere-se à detecção de interações de nanopartículas com células imunes primárias por citometria de fluxo. Para abordar esta questão, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartículas foram empregados como um nanomaterial modelo para descrever o método. As partículas de sílica podem ser produzidas de uma maneira muito precisa em escala nanométrica. Tamanho, forma, e propriedades de superfície, tais como carga ou hidrofobicidade, pode ser afinado para aumentar a sua biocompatibilidade 9. Muitos recursos de SiO 2 nanopartículas lhes permitem ser utilizado como ummodelo para a entrega da droga partículas 10. Além disso, corantes fluorescentes ou pontos quânticos pode ser preso ou ligados a estas partículas nano-oferecendo ferramentas úteis para fins de imagem 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

Nanopartículas são dotados de propriedades muito promissoras para fins terapêuticos e de diagnóstico. Este trabalho descreve um método rápido e confiável de análise por citometria de fluxo para estudar a interação de nanopartículas com células do sistema imunológico. Células imunitárias primárias podem ser facilmente purificadas a partir de tecidos humanos ou de rato por isolamento magnético mediada por anticorpos. No primeiro caso, as diferentes populações de células que funcionam num citómetro de fluxo pode ser distinguida pela luz dispersa para a frente-(FSC), que é proporcional ao tamanho da célula, e a luz dispersa-lateral (SSC), relacionados com a complexidade celular interna. Além disso, os anticorpos marcados com fluorescência contra receptores específicos da superfície celular permite a identificação das várias subpopulações de dentro da mesma amostra. Muitas vezes, todos esses recursos variam quando as células são impulsionadas por estímulos externos que mudam seu estado fisiológico e morfológico. Aqui, de 50 nm de FITC-SiO 2 nanopartículas são usadas como um modelo para identificar the internalização de materiais nanoestruturados em células imunitárias do sangue humano. A fluorescência celular e leve aumento espalhadas do lado após incubação com nanopartículas nos permitiu definir o tempo ea dependência concentração de interação de células de nanopartículas. Além disso, tais protocolos pode ser estendida para investigar Rodamina-SiO 2 nanopartículas interacção com microglia primário, as células do sistema imunológico residentes no sistema nervoso central, isolado a partir de ratinhos mutantes que expressam especificamente a proteína verde fluorescente (GFP) da linhagem monócito / macrófago. Finalmente, a citometria de fluxo de dados relacionados com a nanopartícula interiorização nas células ter sido confirmada por microscopia confocal.

A citometria de fluxo é uma ferramenta útil para identificar e caracterizar as células diferentes, e é a técnica escolhida para identificar células específicas do sistema imunológico, tais como monócitos, granulócitos, células T, células B, células assassinas naturais (NK), as células dendríticas (DC), e outras subpopulações de leucócitos. No esforço para caracterizar melhor o comportamento de células brancas do sangue, em resposta a nanopartículas, realizamos ensaios de internalização com leucócitos primários isolados a partir do sangue de dadores saudáveis, (Figuras 1 e 2) e com a linha celular de monócitos humanos (células THP-1, a Figura 3) . Como apresentado na Figura 1A, os três principais subpopulações de leucócitos no sangue foram claramente identificadas por dispersão para a frente e lateral, após isolamento PBMC. Além disso, depois de FITC-SiO 2 de tratamento, os linfócitos (cinzento), monócitos (azul) e granulócitos (vermelho) têm um n diferentetaxa de internalização anoparticle como mostrado pela intensidade da fluorescência verde (Figura 1B). O protocolo descrito permite a purificação da CD14 monócitos positivos primários de PBMC. Figura 2A relata a citometria de fluxo gráfico de pontos de monócitos CD14 + na presença de FITC-SiO2. Figura 2B mostra FITC-SiO2 internalização quantificada nas mesmas células e expressa nas histograma escala logarítmica. Experiências de internalização semelhantes foram realizados em monócitos THP-1 tratadas com concentrações crescentes de FITC-SiO 2 nanopartículas. As células não tratadas foram utilizados como controlo negativo. Figura 3A mostra um aumento dependente da dose na dispersão lateral com uma frente inalterada espalhamento em células THP-1 da linha celular. Na Figura 3B, em conjunto com os histogramas de SSC e FSC em cada FITC-SiO 2 nanopartículas concentração testada, a intensidade média de fluorescência (MFI) quantificação é apresentado. Estes dados sugerem que o tratamento com FITC-SiO 2 nanopartículas induz uma internalização dependente da dose em monócitos destacadas pelo aumento da granularidade intracelular (dispersão lateral) e fluorescência (canal verde). Para ganhar novos insights sobre o tipo de interação entre células do sistema imunológico e nanopartículas, culturas gliais mistos primários foram isolados e microglia, as células do sistema imunológico residentes sistema nervoso central, foi purificada. A utilização de um modelo de ratinho transgénico expressando microglia fluorescente verde permite a visualização de diferentes mecanismos neuro-inflamatórios. O ratinho transgénico B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J usado neste trabalho expressa a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor 12, CX3CR1. Após 7 dias in vitro (DIV), microscopia de fluorescência mostra uma cultura de células gliais primário misturado com um grande número de astrócitos (GFP celular aderente negativos) e algumas células verdes (GFP positivo, Figura 5A). Neste modelo de rato, três subpopulações da glia podem ser distinguidos por citometria de fluxo com uma única coloração CD11b-anticorpo: o primeiro CD11b - GFP - (astrócitos e outras células da glia), um segundo grupo distinto de células microgliais GFP CD11b + +, e um terceiro GFP CD11b + - subpopulação (Figura 4A). Estes dois últimos subpopulações são ambos capazes de internalizar nanopartículas com um ligeiro aumento da eficiência da GFP + população (representando a microglia imaturo patrulha pela transcrição de CX3CR1 promotor), como mostrado por citometria de fluxo (Figura 4B). A internalização ocorreu pode ainda ser verificada por meio de microscopia confocal utilizando a mesma concentração final de Rodamina-SiO 2 nanopartículas como mostrado na Figura 5B. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Figura 1. FITC-SiO 2 internalização de nanopartículas em leucócitos isolados. A) frente Representante espalhando (FSC) versus dispersão lateral (SSC) citometria de fluxo gráfico de pontos de Ficoll-Paque leucócitos isolados. B) sobreposição de fluorescência verde histograma enredo dos três principais de leucócitos no sangue subpopulações de células na presença de 1 Nm FITC-SiO 2 nanopartículas (+45 mV) para 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. FITC-SiO 2 internalização de nanopartículas em CD14 + monócitos purificados. A) para a frente Representante espalhando (FSC) versus dispersão lateral (SSC) citometria de fluxo gráfico de pontos de purificadas monócitos CD14 positivas. B) fluorescência verde histograma enredo da subpopulação de monócitos purificada em presença de 1nM FITC-SiO 2 nanopartículas (+45 mV) para 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> Figura 3. Efeitos do FITC-SiO 2 nanopartículas internalização em células THP-1. A) Encaminhar Representante espalhando (FSC) versus scatterin ladog (SSC) citometria de fluxo gráfico de pontos de THP-1 linha celular de monócitos, após 1 h de exposição de FITC-SiO 2 nanopartículas aumento da concentração. B) variação dependente da concentração da dispersão lateral (SSC), a frente de dispersão (FSC) e verde fluorescência na presença de FITC-SiO 2 nanopartículas (+45 mV) para 1 hora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> Figura 4. Rodamina-SiO 2 nanopartículas internalização em microglia primário isolado do B6.129P-CX3CR1 camundongos tm1Litt / J. A) a proteína fluorescente verde (GFP) versus fluxo CD11b-VioBlue citometria gráfico de pontos de prglia misto imary isolado a partir B6.129P-CX3CR1 ratinhos tm1Litt / J. CD11b + GFP + e CD11b + GFP - populações são mostrados no canto superior direito e quadrantes inferior direito, respectivamente B) fluorescência Red sobreposição de histograma trama de subpopulações microglia na presença de 1 Nm Rhodamine-SiO 2 nanopartículas (+45 mV) para 30. min (histograma vermelho) versus controle (histograma cinza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> Figura 5. A visualização de GFP +-microglia. (A) A microscopia de fluorescência em 7 DIV e (B) A microscopia confocalde Rodamina-SiO 2 nanopartículas internalização (setas vermelhas) em GFP +-microglia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.4K visualizações.  Istituto Italiano di Tecnologia.  Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo. 

Vídeo: Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Não-cirúrgico instilação endotraqueal de camundongos com Análise de Pulmões e Drenagem Linfática Nodes Lung por citometria de fluxo

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Estudo das interacções de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...