Name: Vídeo: Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice
Uploaded: 2016-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 13.9K visualizações. The University of Melbourne. This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

JCB e ELH-Y foram apoiadas pelo Departamento de Defesa dos EUA CDMRP Programa de Pesquisa em Autismo (AR11034). NHMRC (1047674) para ELH-Y.The Maio Stewart Bursary-University of Melbourne confiança financiado bolsa para MS. Agradecemos Ali Taher, Fátima Ramalhosa e Gracia Seger para as contribuições técnicas.

manejo dos animais e deslocamento cervical de animais antes de todas as experiências foram realizadas estritamente de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Experimentação Animal da Universidade de Melbourne (Ética ID: 1.212.494,7) 1. Tissue Recolha e Dissection <ol><li> Euthanize camundongos adultos por deslocamento cervical. Se possível evitar a anestesia para evitar influências sobre a função intestinal através de receptores localizados em populações neuronais de interesse. </li><li> Grave peso corporal total do animal, pino do corpo (através das quatro patas, lado ventral expostos ao experimentador) firmemente a uma placa de dissecção utilizando agulhas hipodérmicas (Tamanho: 20 G). </li><li> Usando dissecando pinça e tesouras; fazer uma incisão através da epiderme sobrepondo as camadas musculares abdominais inferiores. Continuar a usar a pinça e tesouras para abrir a cavidade abdominal ao longo da linha média do abdome ao esterno. </li><li> Para evitar que a desidratação dos tecidos, despeje physisalina ological (solução de Krebs: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO3, 11 de D-glucose em mM - borbulhar à temperatura ambiente com gás carbogénio; 95% de O2 e 5 % de CO 2 durante um período mínimo de 20 min) para o conteúdo abdominal, em intervalos regulares (isto é, a cada 30-60 seg) durante o processo de dissecção. </li><li> Para isolar o cólon quando estiver ligado ao ceco e do recto, segurar o ceco (localizado adjacente à extremidade proximal do cólon) suavemente, utilizando fórceps de dissecação de aproximadamente 4-5 cm acima do corpo do animal ao aparar o mesentério usando tesouras de dissecação fina. </li><li> Tome cuidado para não segurar, esticar ou cortar o tecido gastrointestinal durante a remoção do mesentério adjacente. </li><li> Remover o excesso de tecido (ou seja, bexiga urinária e testículos). Com uma tesoura de dissecação grosseira, fazer duas incisões verticais (ou seja, aproximadamente 0,5 cm da linha média) para cortar o osso pélvico na EACH lado do cólon. </li><li> Use uma tesoura fina para separar o reto a partir adjacente tecido pélvico e aparar em torno músculos do cólon. </li><li> Colocar os dois pontos de comprimento completo (a partir de ceco para reto) num copo contendo uma solução salina fisiológica (previamente oxigenada com carbogéneo) e continuar a oxigenar à TA. Remover o ceco e reto usando tesouras de dissecação finas e substituir em proveta. </li><li> pastilhas fecais vazio / conteúdo intestinal a partir de preparações do cólon através da aplicação de pressão positiva suave no final oral, utilizando uma seringa de 5 ml ligado a uma ponta de pipeta 200 uL cheio com solução salina fisiológica. A fim de orientar o tecido, no futuro, utilizar um pino de insectos para marcar a extremidade mais proximal do cólon, em que as estrias na mucosa são visíveis. <ol><li> Modificar a ponta da pipeta de plástico para se ajustar à seringa de 5 ml por remoção de aproximadamente 1 cm da extremidade mais larga / proximal usando uma lâmina de barbear. Para aumentar a taxa de fluxo, alargar a extremidade distal / inferior em corte numa Angle (aproximadamente 45 ° C), utilizando uma lâmina de barbear. </li></ol></li><li> Segure o tecido do cólon suavemente na sua extremidade proximal com uma pinça de dissecação, insira a ponta da pipeta para o lúmen do cólon e soro fisiológico nivelado através do lúmen. </li></ol> 2. Preparação de cólon de tecidos e Experimental Set Up for Imaging Vídeo <ol><li> Solução salina fisiológica através de toda a tubagem nivelado ligado a um banho de órgão dois septadas configurar (Figura 1 e Figura 3), utilizando uma seringa ligada a uma ponta de pipeta de 200 uL. Este passo remove quaisquer detritos dentro da tubagem que poderia bloquear o fluxo da solução. Para tubos especificações referem-se a tabela de materiais. </li><li> Assegure-se que as câmaras de banho de órgãos são continuamente superfusão com solução salina fisiológica borbulhada com carbogénio (95% O 2 e 5% de CO 2, a taxa de 5 mL min -1 Flow). Usando uma sonda de temperatura em intervalos regulares, garantir que o temperature do banho é mantida entre 33 ° C -37 ° C. </li><li> Encher o reservatório de entrada ligado através de uma torneira de passagem de 3 vias para o tubo de entrada com cerca de 20-30 ml de soro fisiológico usando uma seringa de 50 ml. </li><li> Durante a experiência, mantém a pressão no reservatório de fluxo utilizando arubber rolha com um tubo de vidro (5 mm de diâmetro interno) inserido através do seu centro. Certifique-se de que a abertura superior do reservatório entrada está firmemente selado (com o tubo de vidro interior restante não selada). </li><li> Colocar o cólon (5-7 cm de comprimento) para a câmara de banho de órgãos, certificando-se de que ele é inteiramente submerso em solução salina fisiológica. </li><li> Canular cada extremidade do segmento do cólon para os dois tubos de entrada / saída submersos (entrada / tubos de saída de diâmetro diferente podem ser alteradas de acordo com o tamanho do lúmen de tecido, por exemplo. Tecido pós-natal, ratos adultos e cobaia) no banho usando o padrão linhas de costura de algodão. Prendem a extremidade proximal do cólon para o tubo de entrada eoextremidade distai do cólon para o tubo de saída (ligado através de uma torneira de passagem de 3 vias para um tubo de saída vertical; de 6 cm de altura). Certifique-se de que o tecido não é sobrecarregado ou muito relaxado após punção para evitar a interferência com as medições e análises futuras. </li><li> Grave o comprimento do cólon, medindo a distância entre as extremidades proximal e distal utilizando cânulas uma régua 15 centímetros. Isto é importante para a interpretação das variações de comprimento contracção, a velocidade de propagação e os pontos de iniciação contracção. </li><li> Assegurar uma pressão de linha de base estável luminal (cm H2O) é estabelecida antes de começar a experiência. Calcular pressão luminal por medição da distância vertical entre o tecido do menisco de solução salina fisiológica dentro do tubo de vidro do reservatório de entrada (por via oral) e o tubo de saída vertical (anal). </li><li> Manter preparações de tecido, a uma pressão constante intraluminal (por exemplo, 1-2 cm de H 2 O), assegurando que o fluxo de vedação pressu rolhare é mantido constante e que não há bloqueios estão presentes no set up. </li><li> Deixar o cólon para equilíbrio em solução salina fisiológica durante 30 minutos antes de gravar os movimentos intestinais. Entrada para quaisquer bloqueios resultantes nos tubos de entradas ou saídas e removê-los por aplicação de pressão através do reservatório de entrada ou por re-canulação as extremidades oral e anal do cólon. </li></ol> 3. Captura de Imagem e Protocolo Experimental <ol><li> Movimentos intestinais recordes como arquivos de vídeo usando uma câmera de vídeo (30 quadros / segundo, 640 x 840 pixels) posicionado 10-15 cm acima do banho de órgãos em uma réplica de laboratório padrão ficar (Figura 1). </li><li> Abra Dub virtual (software de captura de vídeo) a partir do ícone na área de trabalho. Na guia &quot;Arquivo&quot;, selecione &quot;AVI captura &#39;para visualizar a imagem da câmara. No &#39;Audio&#39; não selecção separador «permitir a captura de áudio &#39;para desativar o som. <ol><li> Na guia vídeo, selecione &quot;compressão&quot; e &quot;DivX6.9.2. Codec &amp; #39; para comprimir arquivos de vídeo para minimizar o uso de espaço de armazenamento. Esta função estará disponível após a instalação do software de compressão &#39;DivX&#39;. </li></ol></li><li> Ajustar manualmente a localização da câmera para que todo o segmento de cólon cânula é visível (com regiões de cânula imediatamente adjacentes às bordas verticais do quadro de vídeo) através de janela do software de captura de vídeo (veja a Figura 1). A fim de melhorar a qualidade de imagem e minimizar as reflexões, anexar um escudo de papel / cartão para o apoio da câmara para bloquear a luz externa para o banho de órgãos. Otimizar a qualidade de vídeo, ajustando as definições de brilho, contraste e exposição utilizando a interface do software da câmera. <ol><li> Antes de gravar, defina um nome de arquivo específico; na guia &quot;Arquivo&quot;, selecione &#39;Definir arquivo de captura&#39; e especifique um nome exclusivo para o vídeo. </li><li> Iniciar a captura de vídeo pressionando &#39;file Capture&#39; do &#39;Capture&#39; barra de ferramentas. Para parar recording selecione o botão &quot;Parar captura &#39;ou a tecla&quot; Esc &quot;no teclado. </li></ol></li><li> Substituir o soro fisiológico contido no interior do reservatório de entrada com uma solução salina fisiológica fresca a cada 30 min. <ol><li> pressão registro luminal (ver 2.9) e utilizando uma sonda de temperatura, anote a temperatura do banho de órgãos. Repetir estes passos ao longo da experiência (isto é, a cada 30 minutos) para assegurar que estas variáveis ​​são constantes. </li></ol></li><li> atividade colônica registro no total para 3 horas (incluindo a aplicação de drogas e duração washout). Para fins de armazenamento de dados, registro de dados em segmentos de vídeo 15 min. Uma experiência completa será tipicamente composto por gravações de vídeo 12 x 15 min. <ol><li> atividade recorde de 1 hora sob condições de controle (soro fisiológico). </li><li> Aplicar a droga (ou superfusão para o banho ou administrados para o lúmen através do reservatório de fluxo) durante 30 min a 1 h. Nota: Diferentes vias de administração podem yield efeitos diferentes 23. </li><li> Aplicar soro fisiológico fresca para o banho ou na luz durante um período de lavagem de 1 hora. </li></ol></li></ol> Processamento 4. Dados e Geração de espaço-temporais Mapas <ol><li> Processo de cada desligada gravação de vídeo usando o software in-house escrito em MATLAB (R2012a, Versão 7.4, disponível a pedido), a fim de gerar mapas espaço-temporais que ilustram a motilidade do cólon. <ol><li> software de análise aberta a partir do ícone na área de trabalho. </li><li> Na janela de comando, digite &quot;Analyse2&quot; para abrir o painel de controle de análise. </li></ol></li><li> Utilize a função de detecção de bordas para gerar mapas espaço-temporais, clicando em &quot;A detecção de bordas para arquivos .avi&quot; na janela do painel de controle. Esta função irá permitir que o software de análise para ler os vídeos recodificadas em formato Audio Video Interleaved (AVI). </li><li> Realizar os seguintes passos sequencialmente para gerar mapas espaço-temporais usando um adaalgoritmo de detecção de borda ptive. <ol><li> Abrir arquivos de vídeo gravados por selecionar a guia &quot;Adicionar arquivos&quot;, selecione &quot;Abrir vídeo &#39;e selecione o local dos arquivos de vídeo. </li><li> A partir dos arquivos de vídeo listados dentro do software de análise, selecione o arquivo de interesse. </li><li> Seleccionar uma região rectangular de interesse dentro do quadro do vídeo, por exemplo, todo o comprimento do cólon, desde o ponto em que o cólon é canulada por via oral para a canulação Anal. Assegurar que os pontos de canulação proximal e distal são adjacentes aos limites verticais da região de interesse. linhas de detecção de flanco (vermelho e verde) será automaticamente aparecem sobrepostos na imagem em tempo real. </li><li> Certifique-se de que as linhas de limiar de detecção de borda são imediatamente adjacentes aos dois pontos em ambos os limites superior e inferior do tecido do cólon (isto pode ser optimizado para cada vídeo, alterando os valores de limiar de detecção do painel de controlo). Certifique-se de que a detecção l bordaines são contínuos ao longo do comprimento do cólon imagem, ajustando o contraste e o brilho utilizando o painel de controlo. </li><li> Digite o comprimento total do cólon (mm) na caixa de diálogo largura (como registrado no passo 2.7). Em seguida, selecione &quot;Gerar mapa de calor&quot;. </li><li> Na janela pop-up, selecione um local para o arquivo a ser salvo e especifique um nome de arquivo para o mapa espaço-temporal. </li><li> Selecione o formato de &#39;.su2 &quot;e selecione&quot; Adicionar à fila&#39;. Nota: O formato .su2 comprime dados para um tamanho menor e vários arquivos de vídeo podem ser adicionados à fila. </li><li> Selecione &#39;Comece a detecção&#39; para gerar mapas espaço-temporais. </li></ol></li></ol> 5. Análise do espaço-temporais Mapas <ol><li> Utilize mapas espaço-temporais para estimar parâmetros como frequência, velocidade de propagação, comprimento e duração da CMMCs, diâmetro do intestino e do ponto de iniciação e direção de contrações. <ol><li> Para iniciar a análise espaço-temporalmapas, tipo &#39;analyse2&#39; na janela de comando como descrito na seção anterior. Em vez de &quot;detecção Edge&quot;, selecione o botão &quot;análise do mapa de calor&quot;. </li><li> Abra os arquivos do mapa espaço-temporais (arquivos .su2) seleccionando a opção &quot;Adicionar arquivos &#39;e especificar a localização dos arquivos previamente obtidos .su2. </li><li> Uma vez que o mapa espaço-temporal é visível no ecrã, especificar uma gama de cores do painel de controlo, assegurando que o mínimo é definido como 1. Note-se que a máxima pode variar 5-10 de acordo com a contractilidade do tecido. </li><li> Selecione &#39;Lock gama de cores&#39; para garantir que todos os mapas a partir de uma única experiência são analisados ​​sob as mesmas condições. </li><li> Certifique-se de que as definições de espaço de tempo são constantes para todos os mapas espaço-temporais de um determinado experimento. </li></ol></li><li> A fim de determinar a frequência CMMC, contar manualmente contracções em mais do que 50% do comprimento do cólon. Estas contracções podem ser visualized como riscas vermelho / laranja (padrão de índice de cor HSV) no mapa espaço-temporal (ver Figura 2 para um exemplo). Outros contracções que são mais curtos ou não se propagam também podem ser identificados e quantificados. </li><li> Se desejar, realizar uma análise mais aprofundada em uma resolução maior a partir destes mapas. Por exemplo, pode ser examinado propriedades específicas, incluindo a velocidade e a duração de cada contracção. <ol><li> A fim de medir a velocidade e duração, selecione o botão &quot;Anotar as ondas de contração&quot; no painel de controle de análise do mapa de calor. </li><li> Em seguida, ampliar para cada CMMC clicando no botão &quot;Zoom&quot; e selecionando a área de interesse. Em seguida, selecione o botão &quot;anotar manualmente&quot; para anotar cada contração, usando o mouse para desenhar uma linha a partir da posição mais inicial ao final de cada contração. Este método pode ser utilizado para medir a velocidade de propagação aparente e a duração de dilatações que parecem propagar (por exemplo, ver umaal final de mapas na Figura 2A, 2B). Nota: Os dados para a velocidade ea duração será exibido na janela de resultados. Estes valores podem ser transferidos para uma planilha de interesse, selecionando a guia &quot;Exportar dados&quot;. anotações indesejados podem ser removidos clicando no botão &quot;Remover anotações selecionado&quot;. </li></ol></li><li> Se desejado, utilizar a coordenadas x e y de os mapas de espaço-temporais (tempo e posição ao longo do cólon, respectivamente) para determinar a posição de início de pequenas contracções ou CMMCs. </li><li> Da mesma forma, a fim de determinar os intervalos entre as contrações, use a função &quot;Anotar&quot; para medir a duração entre as contrações. Tal como anteriormente, estes resultados podem ser exportados para uma planilha selecionando a guia &quot;Exportar dados&quot;. </li><li> A fim de medir a largura do intestino descansando, selecione o botão &quot;Take seção transversal&quot; no painel de análise do mapa de calor. <ol><li> Escolha &#39;Adicionar9; no painel secções transversais temporal. Dê um duplo clique em qualquer local dentro do mapa para gerar uma linha horizontal sobreposto ao mapa de calor. dados relativos ao diâmetro Gut agora será exibido em uma nova janela. </li><li> Para medir o diâmetro do intestino, coloque o cursor em um pico e da calha adjacente para obter largura média intestino para uma condição experimental específico. A alteração do diâmetro do intestino pode ser comparada entre as condições experimentais. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+the+gut+microflora+of+children+with+autistic+spectrum+disorders+and+that+of+healthy+children.">Differences between the gut microflora of children with autistic spectrum disorders and that of healthy children.</a> J Med Microbiol. 54, 987-991 (2005).</li><li>Buie, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation,+diagnosis,+and+treatment+of+gastrointestinal+disorders+in+individuals+with+ASDs:+a+consensus+report.">Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report.</a> Pediatrics. 125, S1-S18 (2010).</li><li>Etherton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-linked+neuroligin-3+R451C+mutation+differentially+alters+hippocampal+and+cortical+synaptic+function.">Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13764-13769 (2011).</li><li>Etherton, M. R., Tabuchi, K., Sharma, M., Ko, J., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autism-associated+point+mutation+in+the+neuroligin+cytoplasmic+tail+selectively+impairs+AMPA+receptor-mediated+synaptic+transmission+in+hippocampus.">An autism-associated point mutation in the neuroligin cytoplasmic tail selectively impairs AMPA receptor-mediated synaptic transmission in hippocampus.</a> EMBO J. 30, 2908-2919 (2011).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin+and+neuroligin+in+the+enteric+nervous+system+and+their+down-regulated+expression+levels+in+Hirschsprung+disease.">Expression of neurexin and neuroligin in the enteric nervous system and their down-regulated expression levels in Hirschsprung disease.</a> Mol Biol Rep. 40, 2969-2975 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+significance+of+neuroligins+in+myenteric+cells+of+Cajal+in+Hirschsprung's+disease.">Expression and significance of neuroligins in myenteric cells of Cajal in Hirschsprung's disease.</a> PloS One. 8, e67205 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+down-regulation+of+neuroligin-2+and+the+correlative+clinical+significance+of+serum+GABA+over-expression+in+Hirschsprung's+disease.">The down-regulation of neuroligin-2 and the correlative clinical significance of serum GABA over-expression in Hirschsprung's disease.</a> Neurochem Res. 39, 1451-1457 (2014).</li><li>Roberts, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+intestinal+motility+patterns+in+fetal+mice+are+not+mediated+by+neurons+or+interstitial+cells+of+Cajal.">The first intestinal motility patterns in fetal mice are not mediated by neurons or interstitial cells of Cajal.</a> J Physiol. 588, 1153-1169 (2010).</li><li>Barnes, K. J., Spencer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+colonic+migrating+motor+complexes+occur+in+mice+lacking+the+endothelin-3+gene?.">Can colonic migrating motor complexes occur in mice lacking the endothelin-3 gene?.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 42, 485-495 (2015).</li><li>Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+neural+oscillators+and+muscle+feedback+are+required+for+the+intestinal+fed+state+motor+program.">Multiple neural oscillators and muscle feedback are required for the intestinal fed state motor program.</a> PloS One. 6, e19597 (2011).</li><li>Heredia, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+role+of+mucosal+serotonin+in+colonic+propulsion+and+peristaltic+reflexes:+in+vitro+analyses+in+mice+lacking+tryptophan+hydroxylase+1.">Important role of mucosal serotonin in colonic propulsion and peristaltic reflexes: in vitro analyses in mice lacking tryptophan hydroxylase 1.</a> J Physiol. 591, 5939-5957 (2013).</li><li>Chambers, J. D., Bornstein, J. C., Thomas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+of+intestinal+segmentation+in+guinea+pigs:+a+combined+computational+modeling+and+in+vitro+study.">Insights into mechanisms of intestinal segmentation in guinea pigs: a combined computational modeling and in vitro study.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 295, G534-G541 (2008).</li><li>Huizinga, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+segmentation+motor+activity+in+the+intestine.">The origin of segmentation motor activity in the intestine.</a> Nat Commun. 5, 3326 (2014).</li><li>Neild, T. O., Shen, K. Z., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatation+of+arterioles+by+acetylcholine+released+from+single+neurones+in+the+guinea-pig+submucosal+plexus.">Vasodilatation of arterioles by acetylcholine released from single neurones in the guinea-pig submucosal plexus.</a> J Physiol. 420, 247-265 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Usando esta técnica de imagem de vídeo, a frequência CMMC foi medida como uma indicação da motilidade do cólon em ratos de tipo selvagem e NL3 R451C, um mouse modelo de transtorno do espectro do autismo 17. Os nossos resultados indicam uma redução no número de CMMCs em ratinhos mutantes NL3 R451C, em comparação com ratinhos de tipo selvagem na presença do antagonista selectivo do receptor 5HT 3/4 Tropisetron sugerindo que os ratinhos NL3 R451C exibem uma...

O sistema nervoso entérico (ENS) representa a rede neuronal intrínseca do tracto gastrointestinal e modula várias funções, tais como a digestão do conteúdo intestinal, absorção de nutrientes e a secreção e reabsorção de fluido. Neurônios do ENS estão localizados nas mioentéricos e submucoso plexos. O plexo mientérico desempenha um papel importante na regulação da motilidade gastrointestinal 1 ao passo que o plexo submucosa é principalmente envolvida no controlo da secreção de 2,3. O plexo mientérico está situado entre as camadas de músculo circular e longitudinal da parede gastrointestinal. A actividade contráctil das camadas de músculo liso da parede intestinal facilita as funções primárias do tracto gastrointestinal através da mistura e impulsionando conteúdo intestinal ao longo do comprimento do intestino 3. Embora o fornecimento do nervo extrínseca ao tracto gastrointestinal do SNC contribui para a função gastrointestinal in vivo, O ENS é capaz de regular a função gastrointestinal de forma independente. Esta característica única permite a investigação funcional dos circuitos neuronais entéricas ea sua contribuição para a motilidade gastrointestinal ex vivo. Colo complexos motor migrante (CMMCs) são espontâneos, eventos neurogénicos que são o padrão motor predominante observado no rato cólon isolado na ausência de partículas fecais 4-9. CMMCs são definidos como contracções rítmicas que se propagam ao longo de uma distância horizontal que é pelo menos metade do comprimento total do cólon (ou seja, a partir do ceco até ao recto) 10. A relação entre CMMCs e os padrões contráteis que impulsionam pelotas fecais está ainda a ser claramente estabelecida, no entanto, algumas diferenças farmacológicas foram relatados 11. No entanto, a capacidade do ENS a funcionar independentemente do SNC e a existência de padrões motores mediada por neurais na IScólon olated proporciona um sistema de ensaio ideal para examinar distúrbios na motilidade resultantes da disfunção subjacente ENS. A espontaneidade dos padrões motores gastrointestinais permite alterações funcionais em resposta a estímulos farmacológicos a ser avaliada. O uso de imagens de vídeo e mapeamento espaço-temporal foi desenvolvido pela primeira vez para analisar quantitativamente pequena peristaltismo intestinal em cobaias 12. Aqui, uma técnica ex vivo é descrito que permite o estudo de rato padrões de motilidade do cólon usando imagens de vídeo e a análise destas gravações para a construção de alta resolução (~ 100 uM, 33 mseg) mapas de diâmetro do cólon em função da posição ao longo do cólon e de tempo (mapas espaço-temporais). Usando o software in-house detecção de flanco (Analyse2; disponível a pedido), os dados de todo o comprimento do cólon segmentos contratantes em tempo real são processados ​​para gerar mapas espaço-temporais para cada experimento. Nesta etapa, arquivos de vídeo (AVI) são summazado e convertido em mapas espaço-temporais usando Analyse2. Mapas espaço-temporais (Figura 2) retratam a contratilidade ao longo do tempo e permitir a medição de vários parâmetros, incluindo velocidade de propagação, magnitude, extensão e duração. Gut diâmetro é também registado em toda a duração da experiência como uma medida da contractilidade global do segmento de tecido. Este método pode ser aplicado para identificar diferenças no ponto de início de complexos contrácteis que poderia indicar a conectividade neural entérico alterada. Um protocolo de imagens de vídeo semelhante concebido para avaliar sedimento de propulsão em cobaias foi avaliado 13 no entanto aqui descrevemos a aplicação da abordagem de imagens de vídeo para a quantificação da motilidade do cólon espontânea (isto é, na ausência de peletes). Nós também fornecemos informações detalhadas para ajudar na dissecção e preparação do tecido gastrointestinal para a abordagem de imagem de vídeo. esteprotocolo fornece aos pesquisadores uma ferramenta acessível e facilmente replicado para análise de controle neural entérica da função gastrointestinal em modelos animais da doença, incluindo modelos genéticos do rato. A técnica de imagiologia de vídeo permite a análise da motilidade do cólon em resposta a vários agentes farmacológicos. Os fármacos podem ser administrados através do lúmen do intestino ou ao banho de órgãos externos para a preparação do cólon. Diferentes regiões do tracto gastrointestinal de rato exibem padrões de motilidade específicas tais como pequena segmentação CMMCs intestinal e no cólon. Esta técnica tem sido utilizada para identificar diferenças de estirpes em pequena função intestinal; sensibilidade diferencial de 5-HT3 e 5-HT4 antagonistas foram observados no jejuno de ratinhos Balb / c e C57 / BL6, devido à natureza polimórfico do gene TPH2 expressa nas duas estirpes 6. O efeito de inibição da 5-HT sobre a motilidade permanece concontroversa, como dados conflitantes tem sido relatado sobre a importância da endógena 5-HT sobre o peristaltismo do cólon e CMMCs 14,15. As alterações na motilidade e pré-pós-natal durante o desenvolvimento e 7, os efeitos de mutações genéticas na motilidade gastrointestinal em modelos animais de doenças 10 também pode ser examinado por utilização de imagem de vídeo. Aqui, ilustramos a utilização do método para um estudo da motilidade do cólon, no modelo de ratinho de NL3 R451C autismo, o qual expressa uma mutação sem sentido no gene que codifica a proteína NLGN3 adesão sináptica neuroligin-3 16. Esta mutação foi identificada pela primeira vez em pacientes diagnosticados com transtorno do espectro do autismo (ASD) 17, que está fortemente associada com disfunção GI 18-22. Nós investigamos se a mutação sináptica NL3 R451C afeta saídas neurais no ENS utilizando a técnica de imagem de vídeo. São apresentados dados que caracterizam CMMCs na linha de base e, em resposta ao 5H serotonérgicaT 3/4 receptor antagonista tropissetrom no modelo de ratinho de NL3 R451C de autismo.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (MW: 58.44)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>KCl (MW: 74.55)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (MW: 156.01)</td><td>Chem Supply</td><td>471-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (MW: 246.48)</td><td>Chem Supply</td><td>MA048</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (MW: 147.02)</td><td>Chem Supply</td><td>CA033</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose anhydrous (MW: 180.16)</td><td>Chem Supply</td><td>GA018-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(MW: 84.01)</td><td>Chem Supply</td><td>GA018-500G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two chambered organ bath&lt;br/&gt; Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Contact Laboratory Directly&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR</td><td>Dow Corning Australia Pty Ltd</td><td>1890573</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning Australia Pty Ltd</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>0912-2006</td><td></td></tr><tr><td>SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing</td><td>Masterflex</td><td>508-008</td><td></td></tr><tr><td>1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing</td><td>Masterflex</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing</td><td>Masterflex</td><td>508-007</td><td></td></tr><tr><td>1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 - 14</td><td></td></tr><tr><td>4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 - 15&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>Masterflex</td><td>96410 -16</td><td></td></tr><tr><td>Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>100-400</td><td></td></tr><tr><td>CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water heater&amp;nbsp; (thermo regulator)&amp;nbsp;</td><td>Ratek&amp;nbsp;</td><td>TH7000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Logitech Webcam</td><td>Logitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virtual Dub - 1.9 11</td><td>virtualdub.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2012a&amp;nbsp;</td><td>Graph Pad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logitech Webcam Software</td><td>Logitech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

video imaging and spatiotemporal maps to analyze gastrointestinal motility in mice

O sistema nervoso entérico (ENS) desempenha um papel importante na regulação da motilidade gastrintestinal (GI) e podem funcionar de forma independente do sistema nervoso central. As alterações na função ENS são uma causa importante de sintomas gastrointestinais e doença e pode contribuir para os sintomas gastrointestinais relatados em desordens neuropsiquiátricas incluindo autismo. Está bem estabelecido que os segmentos de cólon isolados gerar contrações espontâneas, rítmicos conhecido como Colônica Migração Motor Complexos (CMMCs). Um procedimento para analisar a regulação neural entérica de CMMCs em ex vivo preparações de cólon do rato é descrita. O cólon é dissecado a partir do animal e lavada para remover o conteúdo de fezes antes de ser canulada num banho de órgãos. Os dados são adquiridos por meio de uma câmara de vídeo posicionado acima do banho do órgão e convertidos em mapas de alta resolução espaço-temporais através de um pacote de software em casa. Usando esta técnica, os padrões contráteis linha de base e efeitos farmacológicos sobre a função ENS no cólon segments podem ser comparados ao longo de 3-4 h. Além disso, o comprimento de propagação e velocidade de CMMCs podem ser gravados, bem como alterações no diâmetro do intestino e frequência de contração. Esta técnica é útil para caracterizar os padrões de motilidade gastrointestinal em modelos de ratinho transgénicos (e em outras espécies, incluindo ratos e cobaia). Desta forma, as alterações induzidas farmacologicamente em CMMCs são registadas em ratinhos de tipo selvagem e no modelo de ratinho R451C neuroligin-3 de autismo. Além disso, esta técnica pode ser aplicada a outras regiões do tracto gastrointestinal, incluindo o duodeno, jejuno e íleo e em diferentes idades de desenvolvimento em ratinhos.

Até 90% dos pacientes com TEA experimentar uma variedade de desordens gastrintestinais, incluindo a diarreia e a constipação 18,24,25. No entanto, as causas subjacentes a estes problemas gastrointestinais são desconhecidos. Muitas mutações identificadas em pacientes com ASD estão associados a proteínas sinápticas contribuindo para alterações e perturbações na transmissão ou função sináptica. Uma tal mutação, no gene que codifica para a molécula de adesão c...

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Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Vídeo Imagem e Mapas espaço-temporais para analisar Motilidade Gastrointestinal em Ratos

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

video-imaging-spatiotemporal-maps-to-analyze-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K visualizações.  The University of Melbourne. This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Vídeo: Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabricação e Implantação de miniatura de elemento duplo Medidores de tensão para medição<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinal Contrações em roedores.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Bioengenharia

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Imunologia e Infecção

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murino Endoscopia para<em&gt; In Vivo</em&gt; Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Medicina

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Monitor de motilidade gastrointestinal (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Biologia

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualização das células intersticiais de Cajal Network (ICC) em ratos

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Mapeamento espacial e temporal da motilidade em<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparações dos intestinos

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion and absorption. For this reason, some of the motility patterns in the small bowel include segmentation for mixing of luminal contents and peristalsis for their propulsion. Physical properties of luminal contents modulate the patterns of small bowel motility. The mechanical stimulation of GI mechanosensory circuits by transiting luminal contents and underlying gut motility initiate and modulate complex GI motor patterns. Yet, the mechanosensory mechanisms that drive this process remain poorly understood. This is primarily due to a lack of tools to dissect how the small bowel handles materials of different physical properties. To study how the small bowel handles particulates of varying sizes, we have modified an established in vivo method to determine small bowel transit. We gavage live mice with fluorescent liquid or tiny fluorescent beads. After 30 minutes, we dissect out the bowels to image the distribution of fluorescent contents across the entirety of the GI tract. In addition to high-resolution measurements of the geometric center, we use variable size binning and spectral analysis to determine how different materials affect small bowel transit. We have explored how a recently discovered "gut touch" mechanism affects small bowel motility using this approach.

To study how the small bowel handles particulates of varying sizes, we have modified an established in vivo method to determine small bowel transit.

Estudando o Mecananosense do Intestino Delgado Urinário de Partículas Luminais

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Vídeo Imagem e Mapas espaço-temporais para analisar Motilidade Gastrointestinal em Ratos

Resumo

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