Name: quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
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Este trabalho foi financiado pelo programa Bernard L. Schwartz para cientistas de médico na Universidade Rockefeller, fundo de desenvolvimento terapêutico de Robertson da Universidade Rockefeller, e o centro de Sackler de Biomedicina e nutrição pesquisa na Universidade de Rockefeller.

todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade Rockefeller &#39; s institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização. Todos os animais estavam alojados em condições específicas isentos de organismos patogénicos.
 1. quimiotaxia In Vitro e <ol><li>cultura THP-1 células 6 em Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 4-(2-hidroxietil) -1- piperazineethanesulfonic ácido (ácido HEPES 25mm) (completar a mídia), mantendo a densidade entre 0,5-1,0 x 10 6 células/mL.</li>
	<li>Cultura de células em um 35 mm prato, etiqueta 3.5 x 10 5 THP-1 células por condição com acetoximetil calceína (calceína-AM; 2,5 µM) ou outra apropriada tintura fluorescente em mídia completa a 37 ° C por 30 min. 
	Nota: Corantes devem ser permeável a membrana celular e compatível com live-célula rotulagem.</li>
	<li>Pré-aquecer um leitor de placas a 37 ° C. 
	Nota: Além do controle de temperatura, funcionalidade de leitura de fundo também é necessária. Consulte a etapa 1.10.2 para uma alternativa para um leitor de placas para quantificação de migração células.</li>
	<li>Enquanto as células estão rotulando, preparar a placa de ensaio e câmara inferior.
	Placa <ol><li>uso de cultura de tecido 24-bem, com uma condição por bem. Realizar cada condição em triplicado.</li>
		<li>Adicionar 750 µ l de Hank &#39; s solução de sal de tampão (HBSS) tamponada com 25mm HEPES e 0,1% albumina de soro bovino (BSA) para a placa de 24. Isto serve como condição o controle basal.
		<ol><li>Uso outro poços para condições de comparador, mantendo sempre o volume total na câmara inferior a 750 µ l. 
			Nota: Neste exemplo, monócitos humanos quimiotático proteína-1 (MCP-1) serve como o controle positivo para quimiotaxia 7.
			<ol><li>Montar a mistura reagente combinando HBSS com 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Usar soro bovino adulto (2,7% v / v) com 1-MCP como um controle positivo adicional. 
				Nota: Concentração Chemokine e chemokine dependerá do eixo quimiotático sob estudo. MCP-1 liofilizado é resuspended em água destilada com BSA (0,1%) tornar-se uma solução com uma concentração final de 50 μg/mL. Isto pode ser diluído em água para uma solução de trabalho de 10 μg/mL. Adicionar 5.6 μL desta solução à câmara inferior.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Após a composição das câmaras de fundo estiver concluída, coloque uma inserção porosa em cada poço, garantindo que as guias do inserto de alinham com os entalhes da placa. 
		Nota: Escolha o tamanho de poro adequado para as inserções. Para monócitos e linfócitos, um tamanho de poro de 3 μm executa bem. Alguns tipos de células e/ou sistemas de chemokine podem exigir uma superfície revestida de matriz para migração ideal. Por exemplo, para medir a quimiotaxia de monócitos THP-1 no sentido de MCP-1, fibronectina ou inserções de colágeno-revestido são recomendadas. Para o leitor de placas para quantificação, a inserção deve ter um revestimento impermeant-luz, como o tereftalato de polietileno, para evitar a deteção de não-migração células na parte superior de câmara 8.</li>
	</ol></li> <li>Após incubação de células por 30 min com calceína-AM, transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15mL. Células de centrifugar a 1.000 x g por 2 min. inspecionam visualmente as células para confirmar a aceitação de calceína-AM ( Figura 1).</li>
	<li>Remover cuidadosamente o sobrenadante usando um aspirador a vácuo. Lave pilhas etiquetadas em soro livre RPMI 1640 suplementado com HEPES 25mm. Centrifugar as células a 1.000 x g por 2 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Os eritrócitos em soro livre RPMI 1640 suplementado com HEPES 25mm. Contar as células e ajustar o volume para que as células estão em uma concentração final de 1.0-1.5 x 10 6 células/mL.</li>
	<li>Dispensar 250 μL da suspensão de células para a inserção (câmara superior).</li>
	<li>, Depois de todas as câmaras superiores foram preenchidas, delicadamente levantem a placa e inspecionam a parte inferior para a presença de bolhas de ar que podem interferir com a migração e a deteção. Para remover uma bolha, primeiro tente remover em seguida re-posicionamento da inserção. Se malsucedido, usar uma agulha 27G para perfurar a bolha e, em seguida, coloque novamente a inserção.</li>
	<li>Coloque a placa no leitor de placa previamente aquecido a 37 ° C.
	<ol><li>Leituras de fluorescência Acquire do fundo em intervalos de 1-3 min. Ao usar calceína-AM, defina a fluorescência excitação e emissão de comprimentos de onda em 485 nm e 520 nm, respectivamente. Dependendo do sistema de tipo e chemokine de célula, quimiotaxia ocorre tipicamente mais de 1-4 h ( Figura 2A).</li>
		<li>Como uma alternativa para medições contínuas usando um leitor de placas, imagem dos poços usando um fluorescente microscópio invertido ( Figura 2B) capaz de excitação e detecção de luz em 485 nm e 520 nm, respectivamente. Use uma baixa ampliação para capturar a maioria da parte inferior da inserção. Quantificar as células, processando as imagens com ImageJ ou similares de software 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Transferência adotiva de linfócitos de murino <ol><li>preparação de células de doador <ol><li>Anesthetize semana de 8-12-ratos de doador masculino C57BL/6J velhos com isoflurano anestesia (1-3%), usando um vaporizador. Confirmar a profundidade apropriada da anestesia pelo dedo do pé-pitada.</li>
		<li>Colocar o mouse na posição supina. Fazer uma incisão com um bisturi e localize o baço no espaço peritoneal superior esquerdo. Excisar o baço inteiro e colocar em mídia completa (RPMI suplementado com 10% FBS e 25mm HEPES; 1 mL/baço) no gelo. Eutanásia em animais anestesiados doador por decapitação.</li>
		<li>Moer tecido baço suavemente através de 40 µm de malha de nylon em mídia completa (1 mL /spleen) usando a extremidade de um êmbolo da seringa para fazer uma célula única suspensão e transfira para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Adicionar 4 volumes de lise de potássio (ACK) cloreto de amônio buffer e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para lisar eritrócitos.</li>
		<li>As células a 1.000 x g por 2 min à temperatura de centrifugação e descartar o sobrenadante. Se hemácias permanecem em pelota, resuspenda em tampão de Lise ACK, incubar durante 5 min à temperatura ambiente, centrifugue células a 1.000 x g por 2 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em mídia completa em uma concentração de 2-5 x 10 7 células/mL e, em seguida, estique a suspensão de células através de uma malha de nylon de 40 µm para remover os resíduos de células.</li>
		<li>Label 1 x 10 7 rato de células/destinatário com uma tintura fluorescente compatível com células vivas e que será mantida mediante fixação subsequente, tais como 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentração final 2 μM) 10 . Incubar a 37 ° C por 30 min. 
		Nota: Para controlar a população de mais de um celular, use outras tinturas fluorescentes com populações de células adicionais. Por exemplo, uma parte das células do doador pode ser rotulada com 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoíla) amino) diversos (concentração final 2 μM) 11.</li>
		<li>Adicionar 4 volumes HBSS suplementado com 25mm HEPES, em seguida, centrifugar a 1.000 x g por 2 min e descarte sobrenadante. Resuspenda o pellet em HBSS suplementado com HEPES 25mm para uma concentração final de 1 x 10 8 células/mL.
		<ol><li>Se usando mais de um corante fluorescente, manter as populações de células separadas até imediatamente antes da injeção.</li>
			<li>Transferir uma pequena alíquota (10 μL) de células de cada cor para uma solução fixador (1 mL) para compensação de citometria de fluxo subsequente.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Transferência de linfócitos <ol><li>anestesiamos a semana de 8-12-velhos camundongos C57BL/6J destinatários machos com isoflurano (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Aplicar a pomada veterinária animal &#39; olhos de s para impedir a secagem.</li>
		<li>Brevemente as células do doador vórtice (1 s) e a transferência para a seringa de injeção de 1 mL com 27 G, 0,5 na agulha, combinando populações de células diferencialmente rotulado, se aplicável.
		<ol><li>Transferir uma pequena alíquota (10 μL) de células mistas para uma solução fixador (1 mL) para análises de citometria de fluxo subsequente.</li>
		</ol></li> <li>Colocar animais dadores de bruços. Aplique uma pressão suave caudal a pele dorsal para o olho, fazendo com que o globo ocular para se projetar ligeiramente.</li>
		<li>Direto da agulha medialmente e injetar 100 µ l de suspensão de células de doador retrô-orbitally para cada destinatário do mouse. As células também podem ser injetadas através da veia da cauda.</li>
		<li>, Gradualmente, retirar a agulha de injeção e posicione o mouse sozinho em uma gaiola de recuperação. Monitorar o animal até que ele recuperou a consciência; uma vez totalmente recuperado retorno do animal à habitação social.</li>
	</ol></li> <li>Recolha e análise <ol><li>após 1 h, anestesiar o destinatários ratos com isoflurano anestesia (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Colher o baço (ou outro tecido de interesse) (etapa 2.1.2.) de cada destinatário do mouse e coloque em mídia completa (1 mL/destinatário). Eutanásia em animais anestesiados por decapitação. 
		Nota: Maiores intervalos antes da colheita de tecido irão aumentar a acumulação de tecido através de pelo menos 24 h.</li>
		<li>Moer tecido baço suavemente através de 40 µm de malha de nylon em mídia completa usando a extremidade de um êmbolo da seringa para fazer uma célula única suspensão e transferência para tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Adicionar 4 volumes do lysis ACK buffer e incubam 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 1.000 x g por 2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Os eritrócitos de coloração, o tampão (tampão fosfato salino suplementado com 1% FBS). Contar as células e ajustar para uma concentração final de 3 x 10 7 células/mL. Transferir 100 µ l de suspensão de células para um 96-poço redondo placa inferior.</li>
		<li>Células mancha para marcadores desejadas (consulte a tabela de materiais) para análise por citometria de fluxo. Adicionar anticorpos conjugados fluoróforo (consulte a tabela de materiais) contra marcadores desejadas e incubar a 4 ° C por 20 min no escuro. Adicione 100 µ l tampão de coloração, centrifugue células a 1.000 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 200 µ l tampão de coloração, centrifugue células a 1.000 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender o sedimento na coloração de 125 µ l de buffer e adquirir amostras usando um citômetro de fluxo, usando os procedimentos padrão. 
		Nota: A tinta verde é animada por um laser de 488 nm e a emissão é detectada com filtros dicroicos 505 e 530/30. O corante laranja é animado por um 561 nm e a emissão é detectado por um filtro dicroico 582/15.
		<ol><li>Uso salvou células de 2.1.8.2 para compensar cada tintura fluorescente. 
			Nota: Usando a compensação baseada no grânulo com fluorophores correspondência a excitação e espectros de emissão das tinturas rotulagem resultará em compensação suboptimal.</li>
			<li>Usar as células de entrada salvas da etapa 2.2.2.1 para determinar com precisão a proporção de diferencialmente rotulado entradas células se usando mais do que uma população rotulada ( Figura 3). Calcular a migração específica de tecido com base na relação de rotulado de células sem rótulo ( Figura 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Quantificação da migração celular imune pode ser realizada usando simples e rápida os ensaios in vitro e em vivo. Demonstramos a em vitro quimiotaxia de monócitos humanos em resposta a um gradiente de MCP-1 e aumento pelo soro. In vivo, doador murino splenocytes diferencialmente foram rotulados e após transferência adotiva, foram recuperados do destinatários animais.
Usando um leitor de placa tem a vantagem de vários pontos de tempo de amostragem (...

Imunidade robusta requer a coordenação temporal e espacial complexa de uma miríade de tipos de células, a fim de responder adequadamente a uma lesão, infecção e gerar auto-tolerância. Várias dezenas de receptors do chemokine e seus ligantes correspondentes foram descobertos e caracterizados fornecendo mecanismos moleculares pelos quais células específicas podem ser direcionados em um tecido específico em um tempo específico. Assim, estudar a quimiotaxia e a migração é um componente indispensável de pesquisa de Imunologia. Com efeito, o ensaio descrito em vitro recentemente foi usado como uma ferramenta de triagem para identificar um cofactor quimiotático que acelera a quimiotaxia de células T em direção de quimiocinas, 19 e 21 C C3. A finalidade dos métodos descritos aqui são para permitir avaliações quantitativas de célula imune quimiotaxia em vitro e in vivo.
O ensaio de câmara Boyden (migração celular e invasão) é um método barato, reprodutível e rápido para avaliar a migração de células4,5. No ensaio de padrão, a câmara superior é semeada com células e é separada por uma inserção porosa de uma câmara inferior, na qual as células migram. No momento desejado, células que migraram para a parte inferior da inserção podem ser fixo e manchadas para quantificação por microscopia de luz. No entanto, tais medições restringem a coleta de dados para um único ponto de extremidade, o que impede a coleta de dados dinâmico e podem exigir a otimização extensiva para determinar o ponto ideal de tempo para análise. Aqui, várias adaptações são descritas que permite medições em tempo real, quantitativas e multiplexadas de quimiotaxia em vitro.
Estudos em vivo , é usado um ponto de extremidade funcional, ou seja, o acúmulo específico de células em um compartimento de determinado tecido. Células de doador previamente rotulado são introduzidas animais destinatários através de transferência adotiva. Estas células de doador posteriormente podem ser identificadas por citometria de fluxo após a colheita de tecidos destinatário. Também apresentado é uma estratégia co rotulagem que permite a determinação do tráfico de diferentes tipos de células dentro de um único animal de destinatário. Esse método elimina a variação entre animais da injeção de célula, contas e variabilidade fisiológica de animal para animal.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Adult bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein animal health</td><td>11695-6776-2</td><td>Isofluorane anesthesia</td></tr><tr><td>Cell strainer 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr></tbody></table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Quimiotaxia é a migração ao longo de um gradiente químico específico1. Quimiocinas são Quimiotáticos citocinas que promovem o tráfico celular com especificidade anatómica e temporal2. Quimiotaxia é uma função crítica de linfócitos e outras células do sistema imunológico que podem ser quantitativamente avaliada em vitro. Este manuscrito descreve métodos que permitem a avaliação da quimiotaxia, tanto in vitro e em vivo, para tipos de diversas células incluindo linhas celulares e células nativas. O em vitro, formato baseado na placa permite a comparação das várias condições simultaneamente em tempo real e pode ser concluída dentro de 1-4 h. em vitro ensaio condições podem ser manipuladas para introduzir-se como agonistas e antagonistas, bem como diferencia quimiotaxia de chemokinesis, que é o movimento aleatório. Na vivo avaliação do tráfico, de células do sistema imunológico podem ser rotuladas com vários corantes fluorescentes e usadas para transferência adotiva. A rotulagem diferencial de células permite a populações de células mistas a ser introduzido o mesmo animal, assim, diminuindo a variância e reduzindo o número de animais necessários para uma experiência adequadamente alimentada. Migração no tecido linfoide ocorre em menos de 1h, e vários compartimentos de tecido podem ser saboreados. Citometria de fluxo após a colheita de tecidos permite uma análise rápida e quantitativa dos padrões migratórios de vários tipos de células.

Quando usar tintura de calceína-AM, inspeção visual das células confirmará a captação do rótulo (Figura 1). Leituras de fluorescentes automatizadas controlará a migração como trânsito de células na parte inferior da inserção ao longo do tempo. Estes dados mostram claramente uma indução de migração de células para o MCP-1, bem como um aumento da resposta pelo soro (Figura 2A). Dependendo da força do estímulo ...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K visualizações.  The Rockefeller University. Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Imagem em lapso de tempo de Quimioterapia de Macrophage mouse

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Medicina

Elucidando a cinética das células T: métodos para análise de migração em tempo real

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

Autor em destaque: Compreendendo os mecanismos da doença por meio da análise em tempo real da migração de células T

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Resumo

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Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro

Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Imagem em lapso de tempo de Quimioterapia de Macrophage mouse

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias