Determinar a concentração de uma proteína em amostras é um passo fundamental em muitos ensaios bioquímicos. A determinação fotométrica pode ser feita com pequenos tamanhos de amostra. Quanto mais uma amostra contém substâncias absorventes de luz, menos a luz transmitirá através dela. Isso fornece uma medição quantitativa das substâncias absorventes. Esses conceitos são tão fundamentais para a ciência que os artigos que introduziram duas das técnicas estão nos três trabalhos mais citados de todos os tempos. Este vídeo mostrará os conceitos por trás de algumas das técnicas mais comuns de determinação de proteínas fotométricas, como são realizadas e como os dados coletados são analisados.

A determinação da proteína fotométrica baseia-se na relação entre concentração e absorção de luz. Esta é conhecida como a Lei Beer-Lambert, que afirma que a concentração de uma espécie absorvente de luz é proporcional à sua absorção.

Este princípio está por trás de todos os métodos de determinação de proteína fotométrica.

Para análise direta de absorção, os valores de absorção de amostras de proteínas não residenciais são medidos. Por causa de suas cadeias laterais aromáticas, resíduos de triptofano e tyrosina dão as leituras de maior absorvência a um comprimento de onda de 280 nm.

No entanto, esses aminoácidos - que são dois dos menos frequentemente encontrados em proteínas - estão presentes em diferentes quantidades em cada proteína, de modo que cada determinação é única. Para superar essa limitação, foram desenvolvidos ensaios mais complexos - que não dependem desses aminoácidos.

Um exemplo é o Ensaio de Bradford, onde o corante colorido é adicionado à amostra. O corante, conhecido como Coomassie Blue, responde proporcionalmente quanto mais proteína presente, mais eventos vinculativos com o corante.

Em seguida, a concentração proteica é determinada medindo a absorvância do corante Coomassie Blue, que absorve a luz a 594 nm. No entanto, o ensaio de Bradford é linear sobre uma pequena gama de concentrações, por isso as diluições são frequentemente necessárias antes da análise.

O Método Lowry combina o reagente Biuret, uma solução alcalina de íons de cobre que reagem com ligações de peptídeos, e o reagente Folin-Ciocâlteu, que oxida resíduos de proteína aromática. A mudança de cor resultante da amostra é proporcional à concentração proteica.

A absorção do reagente Folin reduzido pode ser determinada em 750 nm. Como a absorção direta, cada proteína tem uma resposta única, e deve ser calibrada para a proteína de interesse. Agora que revisamos os princípios básicos por trás de alguns dos ensaios mais comuns, vamos ver como a absorção direta e o ensaio de Bradford são realizados.

Para iniciar uma análise direta de absorção, o espectotômetro é calibrado com um branco para determinar a absorção zero. As soluções padrão são preparadas para uso na criação da curva de calibração. Em seguida, uma alíquota do primeiro padrão é adicionada a um cuvette e colocada no espectrômetro.

O valor de absorção em 280 nm é então registrado. Este processo é repetido para cada padrão, usando uma cuvette limpa para cada execução. Uma vez concluída, uma curva de calibração é criada plotando a absorvência versus concentração. A inclinação desta linha é o coeficiente molar atenuante, que relaciona a absorção à concentração.

Em seguida, a amostra desconhecida é adicionada a um cuvette, e o valor de absorção é registrado. Como a análise de dados para os diferentes métodos de determinação fotométrica é semelhante, vamos cobrir isso depois de olharmos para o ensaio de Bradford.

Aqui, o ensaio de proteína de Bradford é realizado com um padrão BSA em uma placa de 96 poços. Para começar, as soluções de estoque da BSA estão preparadas.

As soluções desconhecidas são diluídas com água deionizada para garantir que as concentrações estejam dentro do alcance do ensaio. Dependendo do kit, o corante Coomassie também pode exigir diluição. Em seguida, a curva de calibração é configurada adicionando os padrões BSA à placa de 96 poços.

A água desionizada é adicionada para atingir a concentração necessária para gerar uma curva padrão. A amostra desconhecida deve ser adicionada à placa em triplicados para garantir que uma medição precisa seja tomada. Corante coomassie é adicionado a cada poço, misturando-se com a pipeta.

A água desionizada é adicionada a um vazio, bem como um branco, para medir a absorvência. Depois de esperar 5 min para o corante se ligar, a absorvância é medida em um leitor de placas a 590 nm.

Agora que fizemos alguns ensaios, vamos ver como analisar os dados. Cada método de determinação de proteína fotométrica é baseado na Lei Beer-Lambert.

A absorvância medida dos padrões é usada para criar uma curva de calibração, que é então usada para determinar a concentração de amostras desconhecidas. Esta curva pode ser plotada manualmente, embora ferramentas espectrofotométricas mais novas criem a curva de calibração uma vez que todos os padrões tenham sido medidos. Esses sistemas também calcularão a concentração de proteínas à medida que amostras desconhecidas forem analisadas.

Agora que revisamos como analisar dados de determinação de proteína fotométrica, vamos ver algumas das maneiras como esses procedimentos são utilizados.

Os princípios da determinação da proteína fotométrica também podem ser usados para medir diretamente a concentração de ácido nucleico. O espectrofotômetro de nanodrop aceita amostras de volume muito pequeno em um pedestal opticamente ativo. A absorção é então medida, e o sistema determina automaticamente a concentração de ácido nucleico. Como as proteínas e outras fontes podem interferir nas medições, a pureza amostral é determinada analisando as razões de absorção de 260 a 280 nm e 260 a 230 nm. Ácidos nucleicos puros normalmente produzem proporções de aproximadamente 1,8 e aproximadamente 2,0 para DNA e RNA, respectivamente.

A determinação da proteína fotométrica também pode ser usada na produção de materiais biomiméticos, que são inspirados da natureza para obter respostas celulares específicas. Os adesivos recombinantes são ligados a contas de poliestireno para simular o apego bacteriano às células hospedeiras. O ensaio de Bradford é usado para determinar a eficiência de acoplamento da adesão recombinante às contas na produção do material biomimético.

Os ensaios alternativos de proteína fotométrica podem ser usados na detecção e caracterização de antimicrobianos proteicos. Remazol brilhante corante R azul é covalentemente ligado a bactérias mortas pelo calor. O antimicrobiano proteico é incubado na solução tingida. Em seguida, a amostra é centrifugada, e a absorção do supernante a 595 nm é medida usando um espectrofotômetro microplatográfico. O aumento da absorvência, pelo corante solúvel liberado no sobrenasal das bactérias rotuladas, é uma medida quantitativa da atividade enzimática.

Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre determinação de proteína fotométrica. Este vídeo descreveu os princípios subjacentes da determinação fotométrica, passou por cima de procedimentos gerais para alguns ensaios comuns, e cobriu alguns novos avanços nas técnicas. Obrigado por assistir!