O objetivo geral deste experimento é identificar marcadores moleculares úteis para carcinomas sinonasais e neuroblastomas olfativos de forma simples e eficiente. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do neuroblastoma olfativo e do carcinoma sinonasal, como a identificação de marcadores moleculares para discriminar o subtipo tumoral. A principal vantagem dessa técnica é que podemos obter resultado em menos de seis horas, ou dentro de um dia para o relatório hospitalar.
Demonstrando o procedimento de extração de RNA e PCR em tempo real será a Dra. E demonstrando o procedimento da imunohistoquímica será Giovanni Micheloni, também doutorando do meu laboratório. Para iniciar o procedimento, colete e divida todas as amostras humanas de FFPE em diferentes subgrupos, de acordo com a classificação da OMS de tumores de cabeça e pescoço.
Aqueça as amostras deslizando em um forno a 60 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, reidratar as três seções de FFPE de espessura de micrômetro, lavando-as brevemente em xileno por 10 minutos. Em seguida, lave os slides em 100%95%85% e 75% álcool em série por cinco minutos cada lavagem.
Enxágüe os slides por cinco minutos em água destilada. Posteriormente, bloqueie a atividade endógena colocando os slides em peróxido de hidrogênio 3% aquoso por 12 minutos. Depois, realize a recuperação de antígenos tratando os slides com tampão citrato de 10 milimônios e micro-ondas por 10 minutos.
Após 10 minutos, lave as seções no buffer TBS. Em seguida, adicione 0,2% do Triton X, e incuba-os durante a noite a quatro graus Celsius, com anticorpo OTX2 Anti-Humano de Cabra, diluído a uma proporção de 1 a 100. No dia seguinte, adicione anticorpos secundários de coelhinhas biotinylated, diluídos em 1 a 200, e incubar as seções por uma hora à temperatura ambiente.
Em seguida, trate as amostras com o complexo de peroxidase ABC. Depois, desenvolva a imunoreação usando tetrahidroclodo diaminobenzeno, e contra-colorir os núcleos com hematoxilina harris. Em seguida, desidratar as seções em escala crescente de álcool, e esclarecê-las em uma substância de desobstrução de origem turpine.
Em seguida, monte as seções em um slide com meio de montagem. Após a extração do RNA e transcrição reversa, realize análises quantitativas de PCR em tempo real com tecnologia baseada em sonda e um ciclofator térmico. Prepare o mix de reação pcr usando 12,5 microliters de mix mestre baseado em sonda, 1,25 microliters de cada sonda OTX1, OTX2 e ACTB, 50 nanogramas de CDNA e água sem nuclease até 25 microliters de volume total.
Realize todas as reações em triplicado usando o gene ACTB como o controle endógeno para normalizar os níveis de expressão genética. Em seguida, centrifugar a placa a 1109 vezes a gravidade por três minutos. Em seguida, armazene a placa protegida da luz a quatro graus Celsius, até o experimento.
Para realizar pcr em tempo real, coloque as amostras na máquina. Em seguida, defina o perfil do ciclo de ciclo térmico com um ciclo inicial de partida quente a 50 graus Celsius por dois minutos, e 95 graus Celsius por 10 minutos, seguido por 40 ciclos a 95 graus Celsius por 15 segundos e um ciclo final a 60 graus Celsius por um minuto. Para análise do nível de expressão genética, normalize os níveis de expressão genética através do método de limiar de ciclo comparativo usando o gene ACTB como controle endógeno.
Avalie os níveis de expressão genética usando o método de limiar de ciclo comparativo e plote os resultados. Em seguida, realize análise estatística utilizando o teste t do aluno, considerando resultados estatisticamente significativos com p
A expressão nuclear para OTX1 foi encontrada em todas as amostras de adenocarcinoma tipo não intestinal, enquanto a imunoreatividade pouco ou ausente foi destacada em adenocarcinomas do tipo intestinal. A imunoreatividade intensa esteve presente em todos os neuroblastomas olfativos. Entre todos os carcinomas neuro-endócrinos pouco diferenciados, a expressão OTX variou em intensidade e porcentagem de células positivas.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar cada etapa da extração de RNA em condições estéreis usando também equipamentos estéreis. Paralelamente a este procedimento, outros métodos como análise de raios-X, exame endoscópico de cavidade nasal, tomografia computadorizada, ressonância magnética e biópsia, podem ser realizados para confirmar os resultados obtidos a partir de nossa técnica. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de oncologia explorarem essa doença em modelos celulares.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar marcadores moleculares para discriminar subtipos tumorais usando a imunohistoquímica e PCR em tempo real. Não se esqueça que trabalhar com esses reagentes, instrumentação e amostras pode ser extremamente perigoso e precauções como dPI devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.
