Este método é projetado para responder a perguntas-chave no campo da bioquímica inorgânica, sobre como manter a atividade enzimática em proteínas que contêm metais sensíveis ao oxigênio. A principal vantagem desta técnica é que ela ajuda a visualizar maneiras pelas quais você pode manter o metal de uma proteína em seu estado reduzido. Geralmente, indivíduos novos nessa técnica lutarão porque é difícil manter materiais e reagentes para serem completamente anaeróbicos.
24 horas após induzir a expressão proteica, coletar as células por centrifugação e resuspenque a pelota de célula bacteriana em 20 mililitros de tampão de coluna amilolose por 1,5 litros de crescimento. Adicione um miligrama de lise à suspensão celular e mexa as células por 20 minutos no gelo. Ao final da incubação, lise a solução celular resuspended através de homogeneização de alta pressão com três a cinco passes a aproximadamente 15.000 psi, e transfira a proteína para um tubo centrífuga de 50 mililitros.
Lave o espaço da cabeça com nitrogênio por um minuto, e centrifugar a célula lysate para remover os detritos insolúveis. Transfira o supernatante para pelo menos um tubo de 50 mililitros, e tampe o lise com um septo de borracha. Usando uma agulha de calibre 20, lentamente bolha gás nitrogênio através da solução por dois minutos para deslocar o oxigênio.
Em seguida, enrole o septo com filme de parafina, fixe o Parafilm com fio de cobre e coloque o sobrenante no porta-luvas com os materiais da coluna. Quando o solvente estiver logo acima do leito de resina, em uma coluna de amilolose previamente preparada, carregue 50 mililitros de supernascedores de proteína na coluna, coletando o fluxo em frações de cinco mililitros sob nitrogênio moderadamente pressurizado a aproximadamente cinco mililitros por minuto. Quando todo o fluxo foi elucido, lave a coluna com mais três volumes de coluna de tampão de coluna de amilose.
Adicione cinco CV de tampão de elução e, em seguida, colete manualmente frações de três mililitros em tubos de teste de vidro sob nitrogênio moderadamente pressurizado. Teste as soluções para presença de oxigênio com sulfato de amônio ferroso e dithiothreitol. A solução ficará azul escuro ou preto se o oxigênio estiver presente, como o tubo à direita.
A presença de oxigênio resultará em proteína purificada com baixa atividade catalítica. As soluções com oxigênio mínimo presente serão lavanda ou cor translúcida azul claro, como o tubo à esquerda. Em seguida, use uma linha de nitrogênio externa para pressurizar a câmara celular agitada, e concentrar a proteína em 50 mililitros a uma velocidade de agitação moderada duas vezes.
Em seguida, concentre a proteína em 10 mililitros e filtre a proteína concentrada através de um filtro de seringa de 0,45 micrômetros. Alíquota de 150 microliters de proteína em tubos individuais de reação em cadeia de polimerase de 200 microliteres. Em seguida, remova as alíquotas tampadas do porta-luvas para congelamento imediato de flash em nitrogênio líquido e armazenamento a menos 80 graus Celsius.
Para desalar DesB, primeiro adicione três mililitros de gel de desalagem de desarmes Sephadex G-25 a uma coluna de borossilicato de nove mililitros, e lave a coluna com dois volumes de coluna de tampão desgase desgaseado. Quando o DesB tiver descongelado, carregue a proteína purificada na coluna através de um processo controlado pela gravidade, e descarte o fluxo antes de eludir três gotas de proteína em cada um dos 12 frascos, com aproximadamente cinco mililitros de tampão de desalamento. Para preparar o eletrodo de oxigênio, use uma tesoura para cortar um aproximadamente 1,5 polegadas quadrada de papel espaçador, e corte pequenos triângulos em cada face do quadrado, com fendas nos cantos para ajudar na embalagem do eletrodo.
Adicione cinco gotas de uma solução de cloreto de potássio de 50% no sulco do ânodo prateado do eletrodo, e conecte as gotas para que elas formem um anel contínuo de solução. Adicione duas gotas da solução de cloreto de potássio ao topo do eletrodo de platina, e coloque cuidadosamente o papel espaçador em cima do eletrodo de platina, alisando o papel espaçador para que não haja bolhas de ar. Corte um pedaço de aproximadamente duas polegadas de comprimento da membrana S4 30m PTFE, e coloque-o em cima do papel espaçador, removendo as bordas da membrana para que estejam alinhadas com o anel externo do eletrodo.
Usando um aplicador de anel O, empurre um pequeno anel O sobre o eletrodo para fixar o papel e a membrana do espaçador no eletrodo, e coloque um anel O maior sobre o sulco circular do eletrodo, tomando cuidado para que não haja membrana por baixo. Deslize a câmara superior do eletrodo sobre a base e enrosque as duas peças juntas. Coloque o eletrodo montado em sua base e conecte o eletrodo ao sistema de monitoramento.
Para determinar a taxa de reação enzimática, use um eletrodo do tipo Clark sensível ao oxigênio, com integração computacional para medir o consumo de oxigênio através da unidade de controle de eletrodos. Adicione um mililitro de tampão Tris no volume apropriado de substrato à câmara de eletrodos e mexa a solução por 10 segundos. Após 10 segundos, sele lentamente a câmara com o êmbolo e aparasse a parte de cima para baixo.
Use um tecido limpo para absorver o excesso de líquido deslocado da câmara, e permitir que o eletrodo se equilibre onde possa produzir uma medição estável da concentração de oxigênio na solução por pelo menos um minuto. Em seguida, use uma seringa de 10 microliters para adicionar aproximadamente um microliter de enzima à câmara de eletrodos através do êmbolo, e coletar os dados da taxa. Quando toda a taxa para uma determinada concentração de substrato tiver sido coletada, use um tubo plástico conectado a um frasco de vácuo de braço lateral para esvaziar a câmara de eletrodos, e enxágue repetidamente a câmara por quatro a seis ciclos com água.
Em seguida, configure a solução no eletrodo como apenas demonstrado, usando uma nova concentração de substrato. A análise do gel SDS-PAGE de frações individuais da fusão de proteínas de ligação DesB-maltose revela o isolamento de um produto de proteína pura, além da presença de produtos de domínio proteico de ligação de DesB e maltose que se separaram uns dos outros. Uma vez que todas as medidas cinéticas tenham sido tomadas, a atividade de DesB com gallate, por exemplo, pode ser obtida medindo a taxa de consumo de oxigênio em concentrações de galate variando.
Por outro lado, a taxa de inibição do DesB com quatro nitrocatecol pode ser determinada observando a redução da taxa de consumo de oxigênio de DesB com um mililitro na presença de concentrações variadas de quatro nitrocatecol, indicando, por exemplo, que quatro nitrocatecol inibe o consumo de oxigênio e, assim, a reação de DesB. Embora este método possa fornecer insights para o estudo de enzimas dioxygenase dependentes de ferrosos, ele pode ser aplicado a outros sistemas, como outros metalloenzymes. Não se esqueça que trabalhar dentro de um porta-luvas pode ser um desafio, então tome cuidado para não correr enquanto executa essa técnica.
