Esse método pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da audição e do equilíbrio. Descreve como detectar dois aspectos importantes da função das células ciliar sensoriais, mechanotransdução e atividade pré-sináptica. As principais vantagens dessa técnica são que ela nos permite visualizar a função das células ciliar em um animal vivo, e estudar como as coleções de células ciliar detectam e transmitem informações sensoriais.
Para iniciar este procedimento, use fórceps finos e fio de tungstênio para moldar os pinos a serem usados para imobilizar a larva através da cabeça e cauda, no encapsulante endurecido. Para fazer pinos de cabeça, segure um pedaço de fio de tungstênio de 0,035 milímetros em uma mão. Usando fórceps finos na outra mão, dobre o fio um milímetro até o final, a 90 graus.
Troque os fórceps por uma tesoura fina e corte um milímetro após a curva, para criar o pino. Em seguida, use fórceps para inserir os pinos no encapsulamento endurecido na câmara. Posicione a larva no centro da câmara de perfusão para que ela fique plana de lado contra o encapsulante de silicone.
Usando fórceps finos, leve o pino de cabeça de 0,035 milímetros para baixo perpendicular para a larva. Insira o pino da cabeça entre o olho e o vesícula otic, e para baixo no encapsulante. Use um segundo conjunto de fórceps para estabilizar a larva ao longo de seu lado dorsal e ventral, enquanto fixa.
Certifique-se de que a parte horizontal do pino entra em contato com a larva e não pressione todo o caminho até o encapsulante. Angule o pino ventrally, ou apontando ligeiramente para o anterior da larva, para evitar interferir com a injeção cardíaca subsequente e a imagem das células ciliar. Usando os fórceps, insira um pino de cauda de 0,025 milímetros no notochord, o mais próximo possível da extremidade da cauda.
Para injetar bungarotoxina alfa na larva, enchir três microliters da solução na agulha de injeção, usando uma ponta de pipeta de carregamento de gel. Carregue a solução uniformemente até a ponta, sem bolhas. Em seguida, insira a agulha de injeção cardíaca em um suporte de pipeta ligado a um micromanipulador manual.
Sob um microscópio estéreo, posicione a agulha para que ela esteja alinhada perpendicularmente ao eixo AP da larva anestesiada, apontando para baixo em um ângulo de 30 graus. Em seguida, conecte o suporte da pipeta ao injetor de pressão. Injete um bolus de bungarotoxina alfa na solução, para testar se a ponta da agulha está clara.
Se não for vista a cor vermelha, raspe delicadamente a ponta da agulha contra a borda de um pino, e tente novamente, até que a agulha esteja limpa. Posteriormente, avance a agulha em direção ao coração, até que toque a pele fora do coração. Pressione a agulha na larva e procure o recuo da célula pigmentada na pele em frente ao coração para garantir que a agulha esteja posicionada no plano correto, em relação à larva.
Em seguida, avance a agulha mais longe, até perfurar a pele e entrar na cavidade cardíaca. Puxe a agulha para trás ligeiramente, e injete um bolus de bungarotoxina alfa na cavidade cardíaca. Procure a inflação da cavidade cardíaca, ou para corante vermelho entrando na cavidade.
Enxágue suavemente a larva três vezes, com um mililitro de tampão neuronal para remover o MS222 residual. Nunca remova todo o fluido. Mantenha a larva em aproximadamente 1 miléseto de tampão neuronal na câmara de perfusão.
Neste procedimento, enchir 10 microliter de tampão neronal em uma agulha de jato fluido devidamente quebrada usando uma ponta de carregamento de gel. Carregue a solução uniformemente até a ponta sem bolhas. Em seguida, insira a agulha no porta-pipetas ligado ao micromanipulador motorizado.
Coloque a câmara de perfusão em um adaptador de câmara circular no estágio do microscópio. Mova o estágio motorizado para que a larva esteja no centro do campo de visão. Posteriormente, gire o adaptador de câmara circular para que o acesso ap à larva esteja aproximadamente alinhado com a trajetória da agulha de jato fluido.
Utilizando o contraste de interferência de luz e diferencial transmitido, leve a larva ao foco e centralizá-la sob o objetivo de 10x. Então, eleve o objetivo de 10x. Usando o micromanipulador motorizado, leve a agulha de jato fluido para o centro do campo de visão, para que seja iluminada pela luz transmitida e mal toque no tampão neuronal.
Abaixe o objetivo de 10x para focar na larva, a fim de confirmar sua localização. Fuous o objetivo na agulha de jato fluido. Mova a agulha de jato fluido com o micromanipulador no eixo x e y até que esteja em uma posição paralela ao lado dorsal da larva.
Depois, concentre-se na larva. Abaixe a agulha no eixo z e posicione a agulha ao longo do lado dorsal do peixe, a 1 milímetro do corpo. Mova cuidadosamente o adaptador de câmara circular para garantir que a agulha de jato fluido esteja alinhada ao longo da linha média AP da larva.
Em seguida, mude para o objetivo de água 60x. Certifique-se de que o objetivo está emersed no tampão neuronal. Use o foco fino para localizar um neuromas.
Posteriormente, mova o estágio motarizado para colocar o neuromass de interesse no centro do campo de visão. Mantenha a ponta da agulha de jato fluida ao longo do lado dorsal do peixe. Não toque na ponta da agulha de jato fluido na larva ou na superfície da câmara.
Posicione a agulha de jato fluido com o micromanipulador de modo que esteja a 100 micrômetros da borda externa do neuromass. Em seguida, foque até as pontas dos feixes de cabelo apical. A parte inferior da agulha de jato fluido deve estar em foco neste avião.
Defina o grampo de pressão de alta velocidade do modo manual para o externo para receber a entrada do software de imagem. Zero o grampo de pressão de alta velocidade pressionando o botão zero e use o botão de ponto de configuração para definir a pressão de repouso ligeiramente positiva. Confirme a saída de repouso do grampo de alta velocidade usando um manômetro PSI ligado à saída do estágio da cabeça.
Para determinar a pressão necessária para estimular os feixes de cabelo, aplique um estímulo de teste com uma saída de 0,125 e 0,25 volts para 200-500 milissegundos. Para cada estímulo de teste, meça a distância de deflexão das pontas dos cabeleireiros, a kinocilia. Escolha uma pressão que mova os feixes a uma distância de aproximadamente 5 micrômetros.
Certifique-se de que as pontas da kinocilia permanecem em foco o tempo todo. Para adquirir imagens de plano único, selecione um estímulo para entregar durante a aquisição de 80 quadros, após o quadro 30, em 3 segundos. Para medir as respostas mecanosensíveis de cálcio, concentre-se na base dos feixes de cabelo apical e inicie a aquisição de imagens.
Para medir as respostas pré-sinápticas de cálcio, concentre-se na base das células ciliares e inicie a aquisição de imagens. Os passos para visualizar as mudanças espásticas na intensidade do GCaMP6S, dentro de um neuromast durante a simulação, são descritos aqui. O tempo é representado da esquerda para a direita de acordo com o carimbo de ponto.
A linha superior mostra cinco das quatorze caixas temporais de uma sequência de imagem GCaMP6S F de 70 quadros. Na segunda linha, a linha de base foi removida de cada imagem do GCaMP6S F para criar imagens delta F. Na terceira linha, as imagens delta F foram convertidas de escala cinza, para tabela de procuração quente vermelho.
Na linha inferior, a terceira linha foi sobreposta às imagens F na linha superior. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar para ter certeza de que a larva está presa corretamente e usar controles apropriados, como descrito no manuscrito para excluir artefatos de movimento de seus dados. Trabalhar com bungarotoxina alfa pode ser perigoso.
É importante tomar precauções, como usar luvas enquanto manuseia.
