Este protocolo é significativo porque pode ser usado para estudar a presença de biomarcador de glioma por um método que preserva a estrutura 3D das neurosferas tumorais. A principal vantagem deste protocolo é que a morfologia das neurosferas é mantida em comparação com o método citospina no qual as células são submetidas a manipulação estressante e se tornam achatadas. Este método pode ser aplicado a qualquer outro sistema de cultura tecidual em que as células são cultivadas em 3D e a manutenção da estrutura é importante.
Para começar, cultura neurosferas tumorais ou NS em um frasco T-25 até que as células sejam confluentes. Eleja o tumor NS em um tubo cônico de 15 mililitros. Impellet o NS a 300 Gs por cinco minutos.
Depois disso, suspenda a pelota em um mililitro de 10% de formalina e incubar o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos. Adicione cinco mililitros de HBSS ao NS re-suspenso. Impellet as células como descrito anteriormente. Coloque o tubo contendo a pelota no gelo.
Suspenda a pelota NS lavada em 500 microliters de 2% de líquido quente. E misture por um cachimbo suave ou agitação. Coloque a ágarose incorporada NS no gelo até que a agarose polimerize.
Em seguida, remova o pedaço de agarose, segurando o NS. Coloque o pedaço de agarose em uma fita para processamento de tecidos. Coloque um banho de água a 42 graus Celsius. E insira cuidadosamente a lâmina no microtome.
Em seguida, coloque o bloco de parafina no microtome. Com uma mão, pressione para baixo na alavanca que controla a espessura de cada seção localizada no lado esquerdo da máquina. Pressione a alavanca até a segunda parada para definir o microtómeo com uma espessura de 30 micrômetros.
Gire a roda de mão grosseira para começar a aparar o bloco. Uma vez que a superfície da amostra esteja quase exposta, defina a alavanca que controla a espessura para cinco ou 10 micrômetros. Pare de aparar quando a superfície da amostra for atingida.
Encha uma caixa de gelo com gelo e água suficiente para proteger o bloco de parafina de tocar diretamente o gelo. Descarte a lâmina de microtome antiga e insira uma nova para secção. Seque o bloco de parafina com gaze e coloque-o no microtoma.
Gire a roda de mão grosseira para começar a seccionar a parafina. Em seguida, use um pincel úmido para transferir a fita de parafina para o banho de água de 42 graus Celsius. Usando a curva dos fórceps, coloque os fórceps entre duas seções de parafina e empurre as seções separadas suavemente.
Use o pincel úmido para empurrar as seções separadas em slides de microscópio de adesão carregados positivamente. Primeiro, derreta a parafina incubando os slides em um rack de metal a 60 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, desparafinar os slides via incubação em um trem de re-hidratação à temperatura ambiente de acordo com o protocolo de texto.
Armazene os slides na água da torneira para evitar a ligação de anticorpos não específicos. Depois disso, incubar os slides no tampão citrato a 125 graus Celsius por 30 segundos e 90 graus Celsius por 10 segundos. Deixe os slides esfriarem antes de enxágüe-os cinco vezes com água destilada.
Em seguida, incubar os slides à temperatura ambiente em 0,3% peróxido de hidrogênio por 20 minutos. Em seguida, lave os slides por cinco minutos, três vezes na lavagem do tampão com agitação suave. Incubar os slides durante a noite em uma câmara umidificada fixada a quatro graus Celsius com anticorpo primário diluído.
Depois disso, lave os slides três vezes por cinco minutos com agitação suave. Em seguida, incubar os slides em anticorpo secundário biotinilado diluído à temperatura ambiente por uma hora. Lave os slides três vezes durante cinco minutos na lavagem do tampão com agitação suave.
Em seguida, incubar os slides no complexo de peróxido de rabanete avidin-biotinilado a temperatura ambiente no escuro por uma hora. Repita a lavagem como descrito anteriormente. Depois disso, incubar os slides com marcas de substrato de peróxido de hidrogênio DAB por dois a cinco minutos em temperatura ambiente.
Enxágüe os slides com água da torneira e mergulhe os slides na solução de hematoxilina para contratendá-los. Em seguida, enxágue as lâminas completamente na água da torneira até que a água se esclaeça. Desidratar os slides de acordo com o protocolo de texto.
Finalmente, cubra os slides com um meio de montagem à base de xileno e deixe-os secar em uma superfície plana à temperatura ambiente. Neste protocolo, ns são fixos e incorporados em agarose e parafina. E então eles são manchados para biomarcadores glioma específicos.
O nível de expressão do ATRX, uma proteína de acompanhante que media a estrutura da cromatina, é baixo. Ki67, um biomarcador da proliferação celular, é positivo no glioma NS. Finalmente, o NS também é positivo para o OLIG2, um fator de transcrição que media a diferenciação oligodendrocito. A coisa mais importante a se lembrar é suspender as células bem na agarose quente antes de transferir para o gelo, para garantir uma distribuição uniforme das neurosferas.
