Este protocolo é uma alternativa fácil e barata para usar brometo de ethidium para detecção de DNA durante a eletroforese. Removendo brometo de ethidium, a luz UV ou a luz azul podem ser usadas para detecção. A luz azul não é prejudicial ao DNA, o que melhora a chance de sucesso para experimentos a jusante.
É muito fácil experimentar isso. Você só tem que substituir o brometo de ethidium em seus géis por laranja de tiazol. Para começar, prepare 1%mini-géis misturando aproximadamente 0,7 gramas de agarose em 70 mililitros de tris-acetato-EDTA ou tampões tris-borate.
Em seguida, dissolva laranja de tiazol no DMSO para fazer uma solução de estoque de 10.000X. Embora não seja particularmente sensível à luz, armazene laranja de tiazol no escuro quando não estiver em uso. Para armazenamento a longo prazo, faça alíquotas da mistura laranja-DMSO de tiazol e congele-as.
Em seguida, adicione laranja de tiazol a uma concentração final de 1,3 microgramas por mililitro, e micro-ondas a mistura de tampão de agarose e laranja de tiazol para dissolver agarose por aproximadamente 60 segundos. Despeje a mistura de agarose em um aparelho de fundição de gel contendo um pente apropriado, e permita que a solução agarose se solidifique em um gel. Para carregar o gel, primeiro coloque o gel no aparelho de eletroforese, se ainda não estiver presente.
Em seguida, adicione o tampão de execução TAE ou TBE para cobrir a superfície do gel. Em seguida, usando um corante de carga, carregue 10 microliters de uma amostra de DNA. Inclua uma escada de dimensionamento de DNA para referência.
Conecte a tampa e os eletrodos, e execute o mini-gel a 100 volts até que o corante de carga viaje aproximadamente quatro a sete centímetros para um mini-gel. Se a laranja thiazole não foi aplicada antes do fundição de gel, colori o gel, imergindo-o no tampão contendo laranja de tiazol com agitação suave por cerca de 20 minutos ou até que as bandas sejam totalmente detectadas. Para visualizar o gel usando um transilluminador UV, remova o gel do aparelho de eletroforese e coloque-o no transilluminador UV.
Para visualizar o gel usando um transilluminador de luz azul ou uma lanterna, coloque o gel no transilluminador de luz azul ou direcione a lanterna LED azul no gel de cima ou abaixo. Use um filtro de emissão âmbar para filtrar a luz azul, permitindo a visualização da fluorescência dos complexos laranjas de dna thiazole e para proteger os corantes. Para maior digestão ou ligadura, corte as faixas de DNA desejadas do gel e prossiga para extrair DNA usando um kit ou protocolo prontamente disponível.
Selecione as configurações de excitação e emissão apropriadas no aparelho de imagem em gel. Na ausência de um sistema de imagem com filtros apropriados, coloque um filtro âmbar entre a câmera e a fonte de excitação de luz azul-gel. Os limites de detecção são semelhantes entre brometo de ethidium, laranja de tiazol e um corante de DNA comercial comum detectável pela luz azul, com o limite de detecção para todos os três corantes sendo de um a dois nanogramas por pista em um mini-gel.
O gel de agarose manchado de laranja thiazole de um digestor de restrição é detectável quando ele está animado com um UV ou um transilluminador de luz azul ou com uma lanterna de luz azul. Enquanto a laranja thiazole parece ser menos perigosa que o brometo de ethidium, equipamentos de proteção individual padrão, como luvas e óculos, ainda devem ser usados.
