Nosso método visa gerar células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. Esta linha de células-tronco do campo cardíaco permite o estudo de alto rendimento dos mecanismos subjacentes à doença cardíaca congênita, fornecendo um sistema que é favorável à manipulação genética e farmacológica. Existem várias doenças cardíacas congênitas específicas da câmara.
Ao recapitular a cardiogênese in vitro, este protocolo permite o estudo do mecanismo da doença e o desenvolvimento de futuras terapias regenerativas. Este protocolo pode fornecer uma visão de como células progenitoras cardíacas de diferentes câmaras são especificadas durante o desenvolvimento cardíaco. Comece cultivando células-tronco embrionárias de camundongos transgênicos em frascos T25 revestidos de gelatina em 2i médio.
Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, enxágue as culturas com PBS e adicione um mililitro de trippsina por frasco para dissociar a cultura em células únicas a 37 graus Celsius por três minutos. Quando as células se separarem, neutralize a reação com quatro mililitros 10 FBS em DMEM e conte as células por um método apropriado. Diluir as células para aproximadamente três vezes 10 às cinco células por concentração média fresca, e coletar as células por centrifugação.
Em seguida, resuspenque a pelota em cinco mililitros de meio 2i fresco para replacar em novos frascos T25 revestidos de gelatina de 0,1%. Para a geração CPC a partir de esferoides cardíacos, coletar 2,5 vezes 10 para seis da amostra de células-tronco embrionárias do camundongo transgênico destacado por centrifugação, e resuspensar as células em 25 mililitros de meio SFD. Coloque a suspensão da célula em uma placa estéril de 150 por 25 milímetros para incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
No final da incubação, colete os esferoides cardíacos em um tubo cônico. Sedimentar os esferoides por centrifugação para facilitar o isolamento seletivo dos esferoides e evitar células únicas. Resuspend os esferoides em 25 mililitros de médio SFD fresco suplementado com um nanograma por mililitro de ativação A e 1,5 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea quatro.
Replouse os esferoides de volta à mesma placa de cultura para uma incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular. No dia seguinte, lembre-se de todos os esferoides cardíacos por centrifugação. Resuspenque os corpos embrióides diferenciados em 25 mililitros de meio SFD fresco para chapeamento em um acessório ultra-baixo, frasco quadrado de 75 centímetros na incubadora de cultura celular por 48 horas.
Para o isolamento do CPC específico do campo cardíaco usando repórteres fluorescentes, colete os corpos embrionários por centrifugação e dissocia as culturas 3D com um mililitro de trippsina a 37 graus Celsius por três minutos. No final da incubação, misture bem por pipetação para dissociar as células e neutralizar a reação com quatro mililitros de 10% FBS em DMEM. Passe a mistura sobre um coador de 70 micrômetros para remover quaisquer corpos embrióides não dissociados, e sedimente as células filtradas por centrifugação.
Para classificar os CPCs por sua expressão de repórter fluorescente, resuspenque a pelota em 500 microliters SOLUÇÃO FACS e filtrar as células através de um coador de células de 40 micrômetros em um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros no gelo. Em seguida, classifique as células para isolar as células expressas por RFP e GFP pela FACS, coletando as células em um mililitro de FBS. Para isolar cpcs de primeiro versus segundo coração com base em sua expressão de proteína superficial Cxcr4, resuspend células-tronco embrionárias de camundongos RFP expressando células progenitoras cardíacas em 300 microliters de 10% FBS em PBS complementados com anticorpo anti-Cxcr4 conjugado fluorescência.
Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, lave as células três vezes em um a dois mililitros de PBS fresco e frio por lavagem. Após a última lavagem, resuspenja as células em 500 microliters de solução FACS e filtrar as células através de um coador de 40 micrômetros em um tubo de fundo redondo de cinco milímetros. Em seguida, classifique as células por sua expressão Cxcr4, coletando populações Cxcr4-positivas e negativas em tubos individuais contendo um mililitro de FPS por tubo no gelo.
Para reculturar as células progenitoras cardíacas isoladas do campo cardíaco, coletar as células classificadas por centrifugação e resuspensar as pelotas em meio SFD. Em seguida, semente aproximadamente três vezes 10 para as quatro células por poço em uma placa de 0,1% revestida de gelatina, 384-bem. Se o aumento da morte celular for notado após a classificação, adicione o inibidor de ROCK de 10 micromolar a cada poço.
Após dois dias de cultura, deve-se observar espancamento espontâneo. Para analisar a capacidade dos CPCs banhados de diferenciar-se aos cardiomiócitos, coletar as células no dia 12 de diferenciação com trippsina, como demonstrado, para isolar os cardiomiócitos únicos e resuspensar as células em 4%paraformaldeído. Após 30 minutos em temperatura ambiente, colete as células fixas por centrifugação e lave a pelota em PBS para remover o excesso de fixação.
Em seguida, resuspensar as células em 10% FBS em PBS, e incubar metade da amostra celular com anticorpo anti-troponina T do rato e usar a outra metade da amostra como um controle negativo. Após 30 minutos em temperatura ambiente, lave as células duas vezes em PBS fresco e resuspenja as amostras em 10% FBS mais PBS complementado com um anticorpo secundário apropriado. Após outra incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, lave as células duas vezes em PBS fresco por lavagem e resuspenja as células em 200 microliters de PBS por tubo para análise em um citómetro de fluxo.
Após aproximadamente 132 horas de diferenciação, as células progenitoras cardíacas Tbx1-RFP e Hcn4-GFP podem ser detectadas por microscopia de fluorescência. Geralmente, as células GFP e RFP aparecem aproximadamente ao mesmo tempo, e as duas populações de células progenitoras continuam a expandir-se nas proximidades e tipicamente em um padrão complementar. Ajustar as concentrações de ativação A e proteína morfogenética óssea quatro alterará as porcentagens das células progenitoras cardíacas do primeiro versus segundo coração.
Da mesma forma, usando uma linha de células-tronco embrionárias de rato-de-repórter RFP, após 132 horas de diferenciação, aparecem células progenitoras cardíacas positivas de RFP. Após a imunostaining para Cxcr4, RFP-positive, Cxcr4-positivo e RFP-positivo, as células Cxcr4-negativas podem ser isoladas. A imunostaining para troponina cardíaca T no 12º dia de diferenciação confirma que as primeiras células do campo cardíaco se diferenciam principalmente em miócitos.
Da mesma forma, as células derivadas de células progenitoras cardíacas Cxcr4-negativas do RFP dão origem a cardiomiócitos em percentuais muito maiores em comparação com células progenitoras cardíacas positivas Cxcr4. Ocasionalmente, as células-tronco embrionárias do rato não se diferenciam eficientemente e formam um número muito baixo de células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco. O tempo, a concentração e a consistência da adição das citocinas e o número de células são críticos para uma geração bem sucedida de células progenitoras cardíacas específicas da câmara.
Após esse procedimento, os pesquisadores podem analisar as propriedades fisiológicas das diferentes populações de células progenitoras cardíacas para obter mais informações sobre sua especificação e função.
