Há uma crescente apreciação pelo impacto do microambiente mecânico na sinalização celular e migração. Necessitando do uso de abordagens experimentais únicas para fornecer estimulação mecânica às células individuais. Esta técnica permite a manipulação dinâmica do microambi ambiente mecânico sob uma célula em tempo real.
Permitindo a observação de alterações mecanicamente reguladas no comportamento de migração celular e eventos de sinalização subcelular. Demonstrando o procedimento comigo estarão Nyla Naim, uma pós-doutora e Johnathan Patterson, um técnico do nosso laboratório. Comece usando um Chorono-1 para ativar a superfície de vidro de cada deslizamento de cobertura inferior por 20 segundos, antes de imediatamente sobre-colocar 50 microliters de solução de trabalho de silano de ligação em cada deslizamento de cobertura.
Deixe a solução secar por 10 minutos antes de enxaguar os deslizamentos de cobertura duas vezes com 95% de etanol e duas vezes com isopropanol. Em seguida, deixe os deslizamentos de cobertura secarem por aproximadamente 20 minutos. Para deposição de micro-contas fluorescente, primeiro sonicar a solução de micro-contas de trabalho por uma hora.
15 minutos antes do fim da sônica, coloque a tampa ativada deslize verticalmente em um suporte de deslizamento de cobertura cerâmica e transfira o suporte para um limpador de plasma de mesa para tratamento de plasma de ar quarto por três minutos. Em seguida, coloque peças de filme de parafina em tampas de placa de Petri de 60 mililitros, e coloque a capa deslizando sobre os filmes, tocando levemente cada deslizamento de capa para garantir um bom contato entre o filme e o deslizamento de capa. Em seguida, adicione 150 microliters da solução de contas de trabalho ao topo de cada tampa, e aspire imediatamente a solução de etanol a partir do lado das tampas, deixando as contas na tampa.
Para lançar os Hidrogels imediatamente após sua preparação, adicione uma gotícula de 25 microliter da solução Hydrogel ao lado ativado de cada deslizamento inferior, e imediatamente gire as tampas superiores, lado de contas para baixo, para baixo, sobre a gotícula. Deixe os géis polimerizarem por 30 minutos antes de usar fórceps para remover suavemente as tampas. Em seguida, enxágue os géis com três, cinco minutos de lavagem em hepes frescos de 50 miliMoler por lavagem.
Para ativar as superfícies hidrogel, incubar os géis em hepes frescos de 50 miliMoler, complementados com 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, e imediatamente expor os géis a uma lâmpada de arco ultravioleta em uma área fechada por 90 segundos. No final da ativação, lave os géis com três, cinco minutos de lavagem em Hepes frescos, e trate os hidrogéis ativados com 20 microgramas por mililitro de fibronectina por uma hora a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, aspire a solução de fibronectina em excesso e lave os géis três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem.
Após a última lavagem, coloque os Hidrogels em um pequeno volume de PBS e esterilize os géis por 15 minutos sob luz ultravioleta em uma capa de cultura tecidual. Em seguida, lave os géis uma vez em PBS fresco. Para o revestimento celular, semente 2,1 vezes 10 as quatro células de interesse em três mililitros de médio por hidrogel e permitem que as células aderam a 37 graus Celsius por quatro a 18 horas.
Enquanto as células estão se equilibrando, use um puxador de micro-pipeta para puxar um milímetro de diâmetro por 100 milímetros de comprimento borossilicata de vidro micro-pipeta, para obter um afunilador de mais de dois milímetros que reduza para aproximadamente 50 micrômetros de diâmetro no primeiro milímetro, e estende-se a um tubo longo, paralelo de 10 micrômetros no último milímetro. Em seguida, carregue a pipeta em um microforge e modele a pipeta para ter uma ponta de 15 micrômetros que está fechada no final de uma seção de 250 micrômetros, dobrada a aproximadamente 35 graus anjo do resto da pipeta. O diâmetro aproximado na curva deve ser de cerca de 30 micrômetros para dar força à ponta.
Em seguida, coloque um Hidrogel no palco de um microscópio invertido. Cubra o meio com óleo mineral e selecione o objetivo de 10x. Esterilize a micro-pipeta preparada com o álcool de 70%.
Em seguida, insira no suporte de micro-pipeta com o gancho apontado para o prato, e use o manipulador de curso para baixar a pipeta até que o gancho apenas toque a superfície do líquido. Concentre o microscópio nas células aderidas ao topo do gel, e tomando cuidado que o objetivo não esteja em perigo de atingir a amostra ou o estágio, traga o foco acima do gel para encontrar a ponta da micro-pipeta. Gire a pipeta até que a ponta esteja perpendicular ao plano focal, de modo que a ponta emarçada da micro-pipeta esteja apontando para baixo, e refoque na ponta da pipeta conforme necessário.
Concentre-se de volta na camada celular para medir o quão longe a pipeta está da superfície do gel, e concentre-se de volta para um plano que é parcialmente entre o gel e a ponta da pipeta. Em seguida, abaixe lentamente a pipeta para alcançar o plano focal intermediário, e aumente a ampliação para o que será usado no experimento, antes de baixar a pipeta até que ela paire logo acima da superfície do Hidrogel. Para calibração micromumátrica, imagem uma área desprovida de células, uma área com contas, mas sem manipulação, com a pipeta envolvendo o gel, e com a pipeta engajada puxando o gel.
Em seguida, use a imagem J para comparar os campos sem contas com os campos de contas sem engajamento, os campos de contas com o gel engajado, e o gel puxado para calcular os deslocamentos relativos de contas e força aplicada aos géis. Para realizar um ensaio durotaxis, monitore um grupo de células por 30 minutos para identificar células que estão se movendo de forma direcionada. Selecione uma célula que está se movendo constantemente em uma direção e monitore as células da taxa de quadros desejada por mais 30 minutos.
Em seguida, posicione a pipeta cerca de 50 micrômetros na frente do lado próximo da borda principal da célula selecionada, e mova o micro-manipulador de tal forma que o gel seja deformado ortogonalmente para a direção de viagem da célula. Em seguida, observe a célula ao longo do tempo enquanto ela responde ao gradiente local agudo da rigidez hidrogel. Usando esta técnica como demonstrado, os fibroblastos embrionários de ratos movem-se em direção ao aumento da rigidez em gradientes aplicados por uma micro-pipeta de vidro.
As células fibroblastos embrionárias de ratos, expressando transitoriamente o sensor de tensão vinculina em 125 géis de poliacrilamida quilopascal também demonstram a formação de aderências focais nas direções do trecho durante um período de 40 minutos. A análise da Transferência de Energia de Ressonância Forster revela que a vinculina localizada às aderências focais experimenta uma mudança imediata na tensão, quando apresentada com uma estimulação duratática aguda. Ampliando a utilidade deste ensaio para a observação de eventos de sinalização subcelular, em resposta à estimulação duratática.
Se você fizer várias tentativas de esticar uma célula, ou se o microatado escorregar durante o ensaio, comece de novo com uma nova célula para evitar a partida de múltiplos, variáveis, estímulos mecânicos. Além de sua utilidade para o ensaio de durotaxis, essa técnica pode ser combinada com abordagens genéticas, como biosensores, RNAI ou edição de genes para ajudar a delinear os mecanismos moleculares envolvidos na mecanotransdução.
