Elementos cis-regulatórios como promotores e melhoradores são determinantes-chave da expressão genética. Abordagens tradicionais para estudar esses elementos são laboriosas e muitas vezes envolvem o uso de genes heterologos de repórteres. Aqui demonstramos o uso do CRISPR para examinar o papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 na linha celular da leucemia.
O protocolo é simples de executar e permite avaliações rápidas das funções regulatórias genéticas no contexto genético endógeno. Células hematopoiéticas são muitas vezes difíceis de transfeito com métodos baseados em plasmídeos. Neste protocolo, usamos a eletroporação para entregar Cas9 pré-desmontado, guiar RNA, complexos nas células.
As vantagens dessa abordagem incluem o uso de maior eficiência de edição e viabilidade celular, bem como efeitos reduzidos fora do alvo. Além disso, o uso subsequente da análise de fragmentos permite a triagem simples e rápida dos clones mutantes desejados a partir de uma grande quantidade de amostras. Demonstrando o procedimento será Yuk-Lin Yung, técnico do meu laboratório.
Comece projetando dois RNAs CRISPR, um cinco prime e o outro três primo do elemento cis-regulatório alvo, ou CRE. Certifique-se de que um PAM de NGG esteja localizado imediatamente a jusante da sequência de destino para reconhecimento Cas9. Para formar o complexo gRNA, combine o RNA CRISPR e o rastreador RNA no buffer TE de acordo com as instruções do manuscrito, para uma concentração duplex final de 44 micromolar.
Incubar a mistura a 95 graus celsius por cinco minutos e permitir que ela esfrie até a temperatura ambiente. Diluir a nuclease Cas9 recombinante com PBS para uma concentração final de nuclease de 36 micromolar. Em seguida, misture um volume igual da nuclease diluída com cada um dos duplexes gRNA e incuba-os por 20 minutos à temperatura ambiente para permitir que o complexo RNP se forme.
Centrifugar 2,5 milhões de células em um tubo de 1,5 mililitro a 500 vezes g por cinco minutos. Em seguida, descarte o supernascer e suspenda novamente as células em 163 microliters de RPMI 1640 médio sem fenol vermelho. Adicione 16,7 microlitadores do complexo RNP e 3,6 microliters de 100 micromolares de eletroporação para as células e transfira a mistura para um cuvette de eletroporação de 0,2 centímetros, tomando cuidado para não introduzir bolhas.
Eletroporar as células e transferi-las para um frasco de cultura tecidual T-25 contendo 6 mililitros de meio RPMI completo 1640. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Um dia após a eletroporação, diluir as células para 5000 células por mililitro em meio RPMI completo 1640.
E adicione 100 microliters da suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura tecidual de 96 poços. Cultue as células por sete a 14 dias e, em seguida, extrair DNA genômico usando um sistema de purificação de alto rendimento. Adicione 100 microliters de ligação de placa e tampão de lise a cada poço de uma placa de extração de 96 poços, seguido por 50.000 células reinsubradas em 10 microliters de PBS.
Misture o conteúdo do poço com tubos para cima e para baixo. Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos para permitir que o DNA genômico se ligue aos poços. Em seguida, aspire cuidadosamente a solução dos poços e lave-as com 120 microliters de tampão de lavagem.
Seque o prato. Adicione 20 microliters de mistura PCR a cada poço e execute PCR de acordo com as instruções do manuscrito. Uma vez concluída a amplificação, estime a quantidade do produto medindo a concentração de um número selecionado de amostras com um fluorômetro.
Diluir todas as amostras para 0,5 nanogramas por microliter com água livre de nuclease. Misture um microliter do produto PCR diluído com 8,5 microliters de formamida deionizada e 0,5 microliters de padrão de tamanho fluorescente rotulado por corante em uma placa de 96 poços compatível com o analisador genético. Cubra a placa com uma placa septa e desnatura as amostras a 95 graus Celsius por três minutos em um termociclador.
Realize a eletroforese capilar para separar os produtos PCR rotulados e analisar os resultados no software de análise. Verifique o ícone laranja para visualizar os fragmentos rotulados e o padrão de tamanho para avaliar a qualidade da chamada de tamanho. Em seguida, verifique o ícone azul para ver os produtos PCR rotulados.
Identifique os picos correspondentes a produtos do tipo selvagem e mutantes e estime o nível mutante em cada amostra dividindo a área sob o pico mutante pela soma da área sob os picos selvagens e mutantes. Selecione vários pools de células com altos níveis das exclusões esperadas para novas diluições seriais. Repita a extração de DNA, o PCR fluorescente e as etapas de eletroforese capilar e selecione clones com níveis mutantes superiores a 95% para análise subsequente.
Extrair RNA total dos clones selecionados e realizar síntese de DNA complementar. Misture o RNA com um primer poli-T e dNTPs de acordo com as instruções do manuscrito e incubar a 65 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, coloque a reação no gelo por pelo menos um minuto.
Adicione dez microliters de mistura de síntese cDNA à reação. Em seguida, incubar a amostra a 50 graus Celsius por 50 minutos e 85 graus Celsius por cinco minutos em um termociclador. Após a síntese de CDNA, trate as amostras com um microliter de RNase H e incuba-as a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Projetores e sondas TaqMan especificamente para variância de transcrição individual gerada a partir de promotores alternativos e clonar os fragmentos de DNA contendo as sequências de transcrição específicas em DNA plasmídeo. Faça uma série de diluição de dez vezes dos plasmídeos recombinantes como curvas padrão para quantificação da transcrição. Prepare 20 microliters de mistura PCR para cada amostra e execute o PCR em tempo real de acordo com as instruções do manuscrito.
Analise os resultados e normalize o número de cópia das transcrições de destino em cada amostra com um gene de limpeza. Este protocolo foi usado com sucesso para excluir o silenciador intrônico RUNX1 e a exclusão foi confirmada com eletroforese de gel capilar. Os tamanhos esperados dos produtos PCR do tipo selvagem e mutantes são cerca de 500 pares de base e 230 pares de base, respectivamente.
O tamanho dos produtos mutantes pode variar entre os clones por causa de indels formados nos locais de decote. O sequenciamento de Sanger foi usado para confirmar a identidade das exclusões. O gene RUNX1 contém dois promotores, P1 e P2 que produziram três principais transcrições de mRNA:RUNX1c por P1, e RUNX1a e RUNX1b por P2. O PCR quantitativo em tempo real pode ser usado para determinar como a exclusão do elemento silenciador afeta a expressão dessas transcrições.
Um bom design de RNAs CRISPR é importante para sua avaliação do experimento. Certifique-se de que o RNA CRSIPR esteja embalado de perto da região de exclusão pretendida. Além disso, certifique-se de que uma sequência PAM esteja localizada a jusante da sequência de destino para reconhecimento cas9.
Além de estudar CREs, essa estratégia pode ser usada para estudos de localização genética e serve como uma alternativa à interferência de RNA para examinar funções genéticas. Combinando com técnicas de captura de conformação de cromossomo, o CRISPR certamente ajudará a decifrar os envolvimentos de CREs na organização do genoma alterado e expressão genética ligada a vários problemas de saúde, como o câncer.
