A principal vantagem do nosso protocolo de genotipagem é que ele minimiza a contaminação com DNA materno, que é o principal desafio quando genotipagem formalina fixa, parafina-incorporado tecidos molares. A citometria de fluxo é um método rápido e barato que facilita muito o diagnóstico de toupeiras hidatidiformes. Para cada parafina fixa de formalina, ou FFPE, produto de concepção, prepare uma seção de hematoxilina de quatro mícrons de espessura e eosina como detalhado neste vídeo para avaliação morfológica por microscopia.
Coloque os blocos FFPE no gelo por 15 minutos para facilitar a secção. Ajuste o microtome para cortar seções que têm quatro mícrons de espessura para avaliação morfológica microscópica. Coloque o bloco frio no microtome e corte uma seção de cada bloco para coloração de H&E.
Usando fórceps, transfira cada seção para um banho de água de 45 graus Celsius. Pegue a seção do banho de água com um slide carregado positivamente previamente rotulado com o número de identificação da amostra usando um lápis. Coloque os slides contendo as seções em um forno a 65 graus Celsius para permitir que as seções aderam aos slides.
Mantenha os slides no forno por 25 minutos. Realize a coloração de H&E submergindo os slides nos frascos de coloração apropriados para o período de tempo correto, conforme tabulado no protocolo de texto. Monte as seções de quatro mícrons para análise morfológica com meio de montagem.
E cubra com tampa de vidro. Usando os slides de H&E e um microscópio leve, selecione o bloco FFPE que tem a maior quantidade de villi coriônico. E se possível, o bloco que tem villi coriônico se separa e não se mistura com tecidos maternos.
Ajuste o microtome para cortar seções que têm 10 mícrons de espessura para extração de DNA. Corte de 10 a 30 seções, dependendo da quantidade de villi coriônico no bloco. Depois de pegar as seções com slides como antes, coloque os slides contendo as seções em um forno a 65 graus Celsius para permitir que as seções aderam aos slides.
Mantenha os slides no forno por 20 minutos. Realize a coloração de H&E submergindo os slides nos frascos de coloração apropriados para o período de tempo correto, conforme tabulado no protocolo de texto. Deixe os slides sob o capô da fumaça por um mínimo de três horas para que os odores tóxicos de xileno se dissipem.
Usando fórceps, rasgue um pequeno pedaço de papel de um lenço de papel umedecido. Sob um microscópio estéreo leve, use as fórceps e pequenos pedaços de lenços umedecidos de papel umedecidos para raspar todos os tecidos maternos indesejados de manchas de H&E de 10 mícrons de espessura. A chave para este passo é a paciência, especialmente para blocos desafiadores.
Também é importante que outra pessoa dê uma olhada para garantir que nenhum tecido materno seja perdido. Agora, tire um novo pedaço de papel dos lenços umedecidos de papel e use-o para coletar o villi coriônico. Coloque os pedaços de lenços de papel com seu villi coriônico preso em um tubo de 1,5 ml rotulado.
Minimizar a quantidade de lenços de papel usados nesta etapa, pois muito pode entupir a coluna de extração de DNA e, consequentemente, reduzir a quantidade final de DNA coletado. Siga o protocolo de extração de DNA de um kit FFPE para realizar a extração de DNA. Usando um espectrofotômetro de laboratório, carregue 1 microliter de DNA e meça absorvância a 216 nm para quantificação.
Carregue 1 microliter de DNA em um gel de 2% de agarose e execute eletroforese de gel a uma tensão de 80 a 100 volts para avaliação qualitativa. Com base nos resultados da avaliação de DNA, escolha o volume de DNA a ser usado na amplificação PCR de repetição de multiplex curto. Procure usar um mínimo de 1000 nanogramas de DNA.
Proceda à amplificação do PCR, eletroforese capilar e análise de dados conforme descrito no protocolo de texto. Para escolher o bloco FFPE ideal, use slides de H&E em um microscópio leve para selecionar um bloco FFPE que tenha cerca de 50 a 70% de seus tecidos compostos de villi coriônico. Para blocos que não possuem a quantidade ideal de villi coriônico, enriqueça para villi coriônico à medida que a secção é realizada.
Para isso, identifique qual lado das seções recém-cortadas contém villi mais coriônico de acordo com seu slide de H&E correspondente. Em seguida, use uma lâmina para cortar a outra metade que precisa ser descartada para enriquecer para villi coriônico. Para realizar a secção do melhor bloco FFPE possível, corte quatro seções de 50 mícrons de espessura usando um microtómeo.
No caso de um bloco FFPE ideal não estiver disponível, procure manter a razão entre villi coriônico e tecido materno. Por exemplo, se apenas 30% do bloco for composto de villi coriônico, enquanto o resto tem tecidos maternos, então remova pelo menos metade da seção que contém os tecidos maternos, e use mais seções para compensar. Coloque as seções em tubos de 15 mL rotulados.
Para desparafinação e reidratação, trabalhe em um capô de fumaça para adicionar cada reagente e esperar o período de tempo adequado como tabulado no protocolo de texto. Em seguida, remova o reagente por sucção a vácuo com uma pipeta Pasteur. Em seguida, adicione quatro graus Celsius solução de citrato aos tubos de 15 mL.
Depois de colocar em um banho de água de 80 graus Celsius por duas horas, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Remova a solução de citrato por sucção a vácuo. Adicione seis mililitros de 1x PBS, vórtice, e espere de um a dois minutos para permitir que os tecidos se acomodem até o fundo.
Se necessário, centrifufique as amostras a 1000 RPM por 30 segundos. Remova o PBS 1X por sucção a vácuo. Agora adicione um mL de solução de pepsina pré-aquecido e coloque em um banho seco de 37 graus Celsius por 30 minutos.
Vórtice a cada 10 minutos. Prepare o iodida ribonuclease de propídio Uma solução nos últimos 10 minutos desta incubação. Adicione mais seis mL de 1x PBS, vórtice, e espere de um a dois minutos para permitir que os tecidos se acomodem até o fundo.
Novamente, remova o PBS 1x por sucção a vácuo. Adicione 550 microliters do propidium iodide ribonuclease Uma solução, e coloque as amostras em um banho seco de 37 graus Celsius por 30 minutos. Use fórceps para colocar uma peça de cinco cm por cinco cm de malha de filtragem de 48 mícrons na parte superior dos tubos de fundo redondos de poliestireno para uso com o címetro de fluxo.
Filtre a solução tubondo o líquido através da malha e dentro do tubo. As amostras estão prontas para serem executadas no citómetro de fluxo. Mantenha-os embrulhados em papel alumínio até que estejam prontos para serem executados.
Por fim, realize a citometria de fluxo e a análise de dados conforme descrito no protocolo de texto. Genotipagem microsatélite de uma toupeira de higdiforme parcial, juntamente com o DNA da paciente e seu parceiro, revela que a toupeira da paciente é triplo. O primeiro marcador mostra dois picos no produto da concepção.
O primeiro pico é originário da mãe, já que apenas a mãe tem um pico deste tamanho. Seguindo o mesmo raciocínio, o segundo pico vem do pai, já que ele compartilha o mesmo alelo. Observe como o segundo pico é muito maior do que o primeiro, indicando que provavelmente há duas doses do mesmo alelo paterno nesse pico.
A contaminação materna é muito mínima neste produto da concepção porque exibe um pico muito pequeno na posição do segundo alelo materno. O segundo marcador mostra três picos no produto da concepção. Dois desses picos são originários do pai, e um da mãe.
O terceiro e quarto marcadores são semelhantes ao primeiro marcador, e também mostram dois alelos vindos do pai, e um da mãe. Como todos os quatro marcadores mostram consistentemente três alelos, dois originários do pai e um da mãe, pode-se concluir que este produto da concepção é triploide dispermic e confirma o diagnóstico de toupeira parcial. Para a interpretação dos resultados genotipados, é importante estar atento ao nível de contaminação com base nas notas tomadas durante as etapas de limpeza.
Em alguns casos, não podemos chegar a uma conclusão seguindo esses dois métodos. Nesses casos, usamos outros métodos, como o FISH, para descobrir os verdadeiros genótipos. O genotipo microsatélite permitiu um diagnóstico molar preciso e abriu o caminho para entender melhor os genótipos que estão associados às várias características das toupeiras hidatidiformes.
