Nosso protocolo fornece vistas tridimensionais e em larga escala dos vasos linfáticos vertebrais e seus linfonodos drenantes, facilitando o estudo da drenagem linfática e do tráfego linfático das células imunes. O protocolo iDISCO+clearing preserva a integridade dos tecidos, permitindo a localização das células neurais, vasculares e imunes da coluna vertebral, incluindo a medula espinhal, meninges, espaço peridural e linfonodos drenantes. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato anestesiado de 8 a 12 semanas de idade, coloque o mouse em um quadro estereotaxic.
E use um bisturi para fazer uma incisão de pele na região apropriada para a injeção planejada. Use um adaptador espinhal para imobilizar a medula espinhal no nível vertebral Th12-L1 e dissecar os músculos paracervicos ou paraspinais que cobrem o pescoço e a coluna para visualizar a superfície da dura-mater. Em seguida, use uma agulha de calibre 26 para pontuar cuidadosamente a área central do dura mater e aracnoide sub-deitado.
Em seguida, corte dois milímetros de uma ponta capilar de vidro e conecte o capilar a uma cânula ligada a uma seringa de 10 microliter. Carregue o micro capilar com dois a oito microlitadores do rastreador fluorescente de escolha. E introduzir um micro capilar na região medial da dura mater no ângulo apropriado para a injeção planejada.
Empurrando o capilar 1,5 milímetros abaixo da dura-seca, feche a incisão ao redor do capilar com 10 microliters de cola cirúrgica. Quando a cola secar lentamente injete o rastreador fluorescente a uma taxa de um microliter por minuto. Quando todo o volume tiver sido entregue deixe o capilar no lugar por um minuto antes de retrair o micro-capilar.
E feche o orifício de injeção com cola adicional. No momento apropriado após a injeção use a tesoura de dissecção para fazer incisões de pele e peritoneal do abdômen inferior até a gaiola torácica. Abra a gaiola torácica para acessar o coração e insira uma agulha de calibre 26 no ventrículo esquerdo do coração.
Perfuse com 20 mililitros de gelo frio 4% paraformaldeído em PBS, a uma taxa de dois mililitros por minuto. E use uma tesoura para cortar rapidamente o átrio direito liberando o fluxo de fluido de perfusão. Use fórceps para remover completamente a pele e remover os membros com uma tesoura.
Remova todos os órgãos internos, tomando o cuidado de deixar os linfonodos intactos e cortar as costelas. Mergulhe os tecidos dissecados no gelo frio 4% paraformaldeído em PBS em tubos individuais de 50 mililitros durante a noite a quatro graus Celsius, antes de lavar os tecidos fixos três vezes em 50 mililitros de PBS fresco, por cinco minutos por lavagem. Para iDISCO+rotulagem de amostras de montagem integral primeiro, desidratar os tecidos com sucessivas imersões em concentrações ascendentes de metanol na PBS por uma hora por imersão com agitação à temperatura ambiente.
Após a última imersão, incubar as amostras em um metanol de 33%, solução de 66% de diclorometano durante a noite com agitação. Na manhã seguinte, lave as amostras duas vezes com 100% de metanol por uma hora por lavagem em temperatura ambiente. Seguido por uma incubação durante a noite em 5% de peróxido de hidrogênio em metanol a quatro graus Celsius.
Na manhã seguinte, reidrate as amostras gradualmente em imersões sequenciais em concentrações descendentes de metanol na PBS por uma hora por concentração com agitação à temperatura ambiente. Para decalcificar as vértebras incubam as amostras na solução de Morse por 30 minutos à temperatura ambiente. Seguido por duas enxágues na PBS e duas incubações de uma hora, em 0,2% Triton X-100 na PBS, com agitação à temperatura ambiente.
Após a segunda incubação Triton X-100, trate as amostras com solução de permeabilização por 24 horas a 37 graus Celsius. Seguido por uma incubação de 24 horas em solução de bloqueio a 37 graus Celsius. Ao final da incubação da solução de bloqueio, as amostras com anticorpo primário, diluídas em uma solução de 0,2%Tween-20 e 0,1% de heparina em PBS complementadas com 5% de sulfóxido de dimetil e solução de soro de burro de 3% a 37 graus Celsius por seis dias.
Ao final da incubação, lave as amostras com quatro a cinco incubações durante a noite em heparina fresca de 2%Tween-20 e 0,1% de heparina em PBS por lavagem em temperatura ambiente com agitação. Em seguida, incubar as amostras com anticorpos secundários de acordo com as instruções do manuscrito. Após a última lavagem, desidratam amostras com sucessivas imersões em concentrações ascendentes de metanol na PBS por uma hora por concentração.
Seguido por uma incubação durante a noite em 33% de metanol 66% solução de diclorometano. Na manhã seguinte, lave as amostras com duas lavagens de diclorometano de 15 minutos. E limpe as amostras em éter dibenzyl sem tremer por quatro horas.
Para a microscopia de fluorescência da folha de luz, as amostras limpas em um plano transversal no estágio do microscópio sob um objetivo 4X, 0.3. E selecione uma configuração de eliminação de três folhas com uma posição X fixa sem foco dinâmico. Use lasers LED sintonizados em 561 nanômetros e 100 miliwatts e 639 nanômetros e 70 miliwatts.
E afinar a abertura numérica da folha de luz para 0,03. Defina os filtros de emissão apropriados e encha a câmara de microscópio com éter dibenzyl. Em seguida, use a câmera para adquirir pilhas com pilhas Z de 2,5 micrômetros e um tempo de exposição de 30 milissegundos por passo usando o zoom óptico X e 0,8 micrômetros por pixel.
E realizar as aquisições do mosaico com uma sobreposição de 10% no quadro completo. Adquira imagens no formato TIF e converta-as em formato 3D com um programa de software de conversão completa apropriado. Para reconstruir a aquisição de mosaicos com o software Stitcher, abra as imagens e organize manualmente as imagens para reconstituir toda a imagem do mosaico, usando a sobreposição de 10% entre as imagens como guia.
Em seguida, use o software 3D para gerar projeções ortogonais dos dados. Adicionando um atributo de código de cor aos vasos linfáticos e outras estruturas anatômicas em exposição. E defina uma correção gama de 1,47 para os dados brutos obtidos da microscopia de fluorescência da folha de luz.
de acordo com as instruções do fabricante. A combinação de iDISCO+com microscopia de fluorescência de folha de luz preserva a anatomia vertebral e permite a captura da vasculatura linfática dentro dos ossos, ligamentos, músculos e gânglios nervosos circundantes. A injeção de um pequeno rastreador fluorescente vermelho no fluido espinhal cerebral, na cisterna magna ou na região torác lombar da medula espinhal resulta no acúmulo de rastreadores dentro dos linfonodos cervicais profundos 45 minutos após a injeção, indicando a absorção e drenagem do rastreador pelo sistema linfático.
A injeção de rastreador no parenchyma espinhal torácica resulta no acúmulo de rastreadores dentro dos tecidos da medula espinhal e linfonodos de drenagem cervical profundo, mas não na vasculatura linfática cervical e torácica rotulada com anticorpos anti-LYVE-1. A injeção anti-LYVE no parenchyma espinhal toracolumáco resulta na rotulagem tanto dos linfáticos vertebrais quanto de suas conexões linfáticas extra-vertebrais. Comprovando a absorção do rastreador por vasos linfáticos vertebrais e a drenagem linfática em direção ao sistema linfático extra-vertebral.
Execute a injeção de traço com muito cuidado para não perturbar a circulação de CSF. O protocolo iDISCO+é muito oficioso, mas você precisa se adaptar ao tamanho de suas amostras. Após a injeção de rastreamento no sistema nervoso central, a coloração imunológica ou o experimento de imagem ao vivo podem ser realizados pela AUS.
O protocolo iDISCO+pode ser usado para estudar diferentes células, populações e tecidos.
