Nosso protocolo permite testar o deslizamento de metal para implantes ortopédicos contra cartilagem articular e, assim, investigar os efeitos dos implantes focais ou hemiartropa na atividade biossintética de determinada condrocração a principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma visão abrangente das propriedades triológicas e dos efeitos biológicos do carregamento mecânico no emparelhamento da cartilagem. Esta técnica pode elogiar os achados clínicos após procedimentos cirúrgicos como a implantação de implantes metálicos focais para tratar um defeito osteocondral do joelho ou hemiartropa do quadril. Demonstrando o procedimento será Christopher Bauer um pós-doutor do meu laboratório aqui na Universidade do Danúbio.
Use um tribímetro recíproco comercialmente disponível com um cilindro na configuração da placa, capacidades de carregamento vertical e carga ajustável e velocidade deslizante. Além disso, uma célula líquida é necessária para realizar os testes em uma solução lubrificante. Fixar os cilindros osteocondrais no suporte da amostra inferior com a marcação alinhada com a direção deslizante.
Comece determinando a pressão de contato no molbênio de cromo de cobalto no sistema de cartilagem usando uma filme de medição de pressão. Coloque a película de medição de pressão na interface e aplique uma carga estática por 30 segundos para determinar a pressão de contato inicial, o tamanho do contato e a forma. Monte os cilindros de molbdenum de cromo de cobalto na célula de carga superior.
Adicione a solução de teste na célula líquida para submergir o cilindro osteocondral e cobrir a interface deslizante da cartilagem metálica. Defina parâmetros de teste, como descritos em curso de força normal e velocidade de deslizamento que serão mantidos durante todo o teste. Inicie o deslizamento recíproco do cilindro de metal contra a cartilagem articular imersa na solução lubrificante.
Monitorando o coeficiente de atrito durante todo o experimento, encerre o experimento. Após o período de teste do desejo, remova o plugue osteocondral do suporte da amostra enxágüe-o com PBS e armazene-o em média até uma análise biológica posterior. Mantenha as amostras de controle e a solução de teste em temperatura ambiente durante a duração do teste e analise-as juntamente com as amostras que foram expostas ao carregamento mecânico.
Coloque, uma placa de 24 poços em uma balança e zero-a. Enxágüe o plugue osteocondral com PBS e coloque-o em uma placa de Petri. Em seguida, use um bisturi para cortar a cartilagem do enxerto em uma peça bissecto a cartilagem em dois pedaços iguais para que a área de contato seja igualmente distribuída em ambos os pedaços de cartilagem e picadinho meio em pedaços cubos de aproximadamente um milímetro.
Use a segunda metade para a análise da expressão genética transfira a cartilagem picada em um poço da placa de 24 poços e determine que o peso do tecido repita este processo para cada amostra e adicione um mililitro de meio de crescimento a cada poço da placa. Adicione 500 microliters de solução XTT a cada poço e misture a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas após a incubação remover o supernascer e transferi-lo para um tubo de cinco mililitros. Extrair o produto tetrazolium adicionando 500 microlitadores de DMSO ao tecido da cartilagem em cada poço e aplicar agitação contínua por uma hora à temperatura ambiente, remover a solução DMSO e puxá-lo com a solução XTT coletada anteriormente.
Transfira 100 microliters de cada amostra em triplicados para uma placa de 96 poços. Use um leitor de placas para medir a absorvância em um comprimento de onda de 492 nanômetros, e um comprimento de onda de referência de 690 nanômetros. Para isolar o RNA pica a segunda metade do tecido da cartilagem obtida do plugue osteocondral em pequenos pedaços, transfira o tecido para um tubo contendo contas cerâmicas e 300 microliters de tampão licenciado.
Com 1%beta mercaptoetanol use um liseto comercial para homogeneizar o tecido aplicando 6.500 RPM por 20 segundos quatro vezes com uma fase de resfriamento de 20 minutos após cada execução. Adicione 20 microliters de proteinase K e 580 microliters de água livre RNAs a cada amostra, e incuba-os a 55 graus Celsius por 30 minutos. Centrifugar as amostras por três minutos a 10.000 vezes G e transferir o supernasal para tubos de 1,5 mililitro.
Adicione 0,5 volumes de 90% de etanol a cada tubo e misture 700 microliters da amostra para uma coluna de ligação de RNA em um tubo de coleta de dois mililitros e centrifuá-lo a 8.000 vezes G por 15 segundos. Descarte o fluxo e repita a etapa de centrifigação para o resto do lise. Adicione 350 microliters de buffer RW um à coluna.
Centrifuá-lo a 8.000 vezes G durante 15 segundos e descartar o fluxo.. Misture 10 microliters de solução de estoque de DNA e 70 microliters de RDD tampão. Adicione a solução à membrana de purificação do RNA e incuba-a à temperatura ambiente por 15 minutos e adicione 350 microliters de RW tampão à coluna.
Centrifuá-lo a 8.000 vezes G por 15 segundos e descartar o fluxo-through adicionar 500 microliters de RPE tampão à coluna de purificação RNA e Centrifuge-o em 8, 000 vezes G por 15 segundos descarte o fluxo através e adicione mais 500 microliters de RPE tampão à coluna de purificação de RNA, em seguida, centrifuá-lo a 8.000 vezes G por dois minutos coloque a coluna em um novo tubo de coleta de 1,5 mililitros e adicione 30 microliters de RnAs a água livre centrifugar o tubo a 8.000 vezes G por um minuto, para aludir o RNA sintetizado cDNA usando um kit comercial descongelar e misturar todas as regiões, adicionar a amostra de RNA e executar a reação e o cicloviário térmico como descrito no manuscrito de texto. Adicione nove microliters de mix mestre RTQ PCR, e um microlitro de cDNA a cada poço de uma placa de 96 poços com cada amostra em triplicados brilha a placa PCR com óleo de teto e centrifuá-lo a 877 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius realizar RTQ PCR e um ciclo de precisão e térmica. De acordo com as instruções do manuscrito.
Antes de testar a área de contato e a pressão de contato na interface da cartilagem metálica devem ser confirmadas usando uma filme de medição de pressão. Condição de carregamento fisiológico pode então ser confirmada comparando a impressão obtida com inferência de referência para contato definido Um coeficiente de baixo atrito pode ser mantido por pelo menos uma hora com uma área de contato migratório. A composição e estrutura da matriz extracelular podem ser determinadas com açafrão e operada.
A intensidade do açafrão e da mancha O é proporcional ao teor proteoglycan. O teor proteoglycan varia sobre a superfície articular, mas deve ser uniforme em toda a seção de tecido em amostras de linha de base, mostrar extração de glicosaminoglicanos que podem ser neutralizados por carregamento mecânico. A atividade metabólica dos condrocratas articular bovinos é independente do local de colheita, mas mostra um aumento com o carregamento mecânico.
Os níveis de expressão genética de genes específicos da cartilagem aumentaram com condições fisiológicas de carga. Considerando que os genes catabólicos são regulados com área de contato estacionária. Após este procedimento, podem ser realizadas análises adicionais, incluindo determinação de produtos web cartilagem e análise de superfície articular utilizando microscopia eletrônica de varredura e, além disso, tentamos otimizar a lubrificação da cartilagem articular em vários pares tribológicos.
